柑橘潰瘍病菌重組單鏈抗體研究.pdf

1、基因工程重組單克隆抗體(recombination monoclonal antibody，RMA)是90年代以來(lái)，人們利用基因工程重組技術(shù)，有目的地在基因水平上對(duì)抗體分子進(jìn)行切割、拼接或修飾，或者直接合成基因序列，再將重組DNA或重組蛋白基因?qū)爰?xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的一類(lèi)抗體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與單克隆抗體相同，具有穩(wěn)定的免疫特異性。其中單鏈抗體(singe chain variable fragment，ScFv)由于低或無(wú)免疫原性、分子量小、

2、組織穿透力強(qiáng)，成本低，可大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。單鏈抗體可以通過(guò)噬菌體展示技術(shù)或核糖體展示技術(shù)加以制備。其中，核糖體展示技術(shù)完全在體外進(jìn)行，其庫(kù)容量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于噬菌體展示文庫(kù)，此外核糖體展示技術(shù)簡(jiǎn)便的建庫(kù)和篩選方法，勿需選擇壓力，通過(guò)引入突變和重組技術(shù)來(lái)提高靶標(biāo)蛋白的親和力等優(yōu)點(diǎn)都使核糖體展示技術(shù)顯示出了誘人的發(fā)展前景。 國(guó)內(nèi)外關(guān)于植物病原菌重組抗體的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。只有少數(shù)應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)篩選了幾種植物病原菌單鏈抗體

3、，并將其應(yīng)用于診斷研究中。至今無(wú)應(yīng)用核糖體展示技術(shù)篩選植物病原菌單鏈重組抗體的報(bào)道。柑桔潰瘍病(citrus bacterial canker disease，CBCD)是影響全球柑桔種植業(yè)發(fā)展的重大檢疫性病害，其病原菌為地毯草黃單胞柑桔致病變種 (Xanthomonas axonopodis pv．citri)，是國(guó)內(nèi)外重大檢疫性有害生物。因抗病品種和特效藥劑缺乏，美國(guó)、巴西等主要柑桔種植大國(guó)對(duì)柑桔潰瘍病仍然沿用挖除病樹(shù)集中燒毀的根除

4、方法。目前我國(guó)正在實(shí)施的柑桔非疫生產(chǎn)區(qū)建設(shè)，強(qiáng)化植物檢疫，嚴(yán)防疫害傳入的監(jiān)控策略，都迫切需要建立快速、特異、準(zhǔn)確的診斷技術(shù)及防控措施。柑橘黃單孢菌 (Xac) 其細(xì)胞外有一層脂多糖(LPS)，其有助于菌體吸附和吸收養(yǎng)分，增強(qiáng)病菌的抗逆能力，已經(jīng)證實(shí)這些胞外多糖和糖蛋白是影響寄主與病原物接觸識(shí)別或抑制識(shí)別和致病的生化因子。在病原菌與寄主表面接觸時(shí)，識(shí)別作用決定了寄主一病原物互作性質(zhì)。LPS 由類(lèi)脂A、核心多糖和O特異性多糖側(cè)鏈(O特異性L(fǎng)

5、PS)組成。其中O特異性L(fǎng)PS決定病原菌的種屬特異性。 本研究應(yīng)用核糖體展示技術(shù)建立抗柑橘潰瘍病菌單鏈抗體文庫(kù)，用 O 特異性L(fǎng)PS 作為抗原篩選特異于柑橘潰瘍病菌的單鏈抗體，并將篩選的單鏈抗體進(jìn)行表達(dá)、純化、研究其親和力及特異性。本研究篩選的單鏈抗體可為柑橘潰瘍病菌的血清學(xué)診斷提供診斷試劑，而且還可用于進(jìn)一步研究柑橘潰瘍病菌與寄主的初步識(shí)別機(jī)制，為柑橘潰瘍病菌的生物防治提供理論依據(jù)。其主要研究結(jié)果如下： ①利用柑橘潰瘍

6、病菌細(xì)胞懸浮液免疫BALB/c小鼠，免疫后小鼠抗血清效價(jià)為2500倍左右，符合建庫(kù)要求。 ②提取小鼠脾細(xì)胞mRNA，構(gòu)建的單鏈抗體文庫(kù)重鏈大小為350bp左右，輕鏈為650bp左右，經(jīng)linker(Gl<,y3>Ser)<,4>連接后單鏈抗體大小為1.2kb左右。將單鏈抗體文庫(kù)DNA克隆到大腸桿菌JM109中，隨機(jī)挑選了9個(gè)克隆子測(cè)序表明，9條單鏈抗體序列都是開(kāi)放閱讀框，其重鏈分別屬于VH1、VH2、VH3基因家簇，輕鏈屬于VK

7、Ⅰ、VKⅢ、VKⅣ亞基因家簇。每個(gè)單鏈抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)都為不同的 CDR，其中氨基酸序列變化多樣，說(shuō)明構(gòu)建的單鏈抗體文庫(kù)多樣性好，適合于進(jìn)一步進(jìn)行單鏈抗體的篩選。 ③將構(gòu)建的單鏈抗體文庫(kù)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和體外翻譯后，產(chǎn)生了單鏈抗體-核糖體-mRNA(ARM)三聯(lián)復(fù)合體文庫(kù)。用柑橘潰瘍病菌O特異性脂多糖親和篩選翻譯產(chǎn)生的ARM三聯(lián)復(fù)合體，洗滌后，將保留的ARM復(fù)合體解離，釋放mRNA，并對(duì)mRNA進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增得到

8、篩選后的單鏈抗體DNA文庫(kù)，然后重復(fù)體外轉(zhuǎn)錄-體外翻譯-親和篩選-RT-PCR擴(kuò)增過(guò)程，得到反復(fù)篩選幾輪的單鏈抗體DNA文庫(kù)。結(jié)果顯示第一輪核糖體展示后回收的mRNA量非常少，分光光度計(jì)已測(cè)不出其濃度，反轉(zhuǎn)錄。RCR 后，擴(kuò)增得到的條帶非常弱，說(shuō)明在原始未篩選的抗體文庫(kù)中，能與柑橘潰瘍病菌 O 特異性脂多糖作用的單鏈抗體數(shù)量較少。經(jīng)過(guò)三輪篩選后，得到的mRNA量逐漸增多，經(jīng)RT-PCR后，產(chǎn)生了比較亮的擴(kuò)增條帶。說(shuō)明在核糖體展示過(guò)程中，

9、抗原陽(yáng)性的單鏈抗體得到了富集。 ④將未經(jīng)過(guò)篩選的原始單鏈抗體文庫(kù) DNA 和經(jīng)過(guò)三輪篩選的單鏈抗體文庫(kù)DNA與噬菌體表達(dá)載體pCANTAB5E相連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1 中小量表達(dá)。表達(dá)后用間接ELISA 測(cè)定單鏈抗體與抗原的結(jié)合活性。結(jié)果表明從未經(jīng)過(guò)篩選的原始單鏈抗體文庫(kù)中隨機(jī)挑取的60個(gè)克隆子表達(dá)產(chǎn)物與柑橘潰瘍病菌 O 特異性脂多糖幾乎沒(méi)有結(jié)合能力；而從經(jīng)過(guò)三輪篩選后的單鏈抗體文庫(kù)中挑取的60個(gè)克隆子中有30％與單鏈抗體有

10、較好的結(jié)合能力。從三輪篩選后的單鏈抗體文庫(kù)中共挑取了180個(gè)克隆子，用間接ELISA 法初篩到60株抗原陽(yáng)性的單鏈抗體；然后用生物傳感技術(shù)(biosensor，biacore)對(duì)篩選的抗原陽(yáng)性的單鏈抗體進(jìn)行了復(fù)篩，篩選了3株高親和力的單鏈抗體(Gx13、GX44和GX95)以用于下一步的表達(dá)鑒定。 ⑤將篩選的高親和力抗原陽(yáng)性的克隆子從大腸桿菌 TG1 中轉(zhuǎn)入高表達(dá)菌株HB2151中進(jìn)行可溶性表達(dá)。并優(yōu)化了表達(dá)條件。優(yōu)化的表達(dá)條件

11、如下： 將單鏈抗體單克隆子接種于5 ml 2×YTAG中，30℃250 r/min培養(yǎng)過(guò)夜；次日將1ml過(guò)夜培養(yǎng)液加入50 ml 2×YTAG(2×YT培養(yǎng)基中含2％葡萄糖，100μg/ml氨芐青霉素)中，30℃250 r/min培養(yǎng)至OD<,600>為0.6-0.8；3500 r/min離心20 min，棄去上清；50 ml 2×YTAI(2×YT培養(yǎng)基中含1 mM IPTG，100 μg/ml 氨芐青霉素)重懸沉淀，30℃2

12、50 r/min培養(yǎng)7 h；3500 r/min離心20 min，沉淀用0.5 ml冰冷的1×TES(0.2 MTris-HCl [pH 8.0]，0.5 mM EDTA，0.5 M sucrose)重懸，再加入0.75 ml冰冷的1/4×TES，Vortex重懸，冰上孵育30 min，高速離,10 min，留取上清，-20℃保存，此上清中含有分泌至細(xì)胞周質(zhì)中的(perplasmic extract)抗體。 ⑥單鏈抗體表達(dá)后，其

13、表達(dá)產(chǎn)物主要集中于細(xì)胞周質(zhì)提取物中，具有抗體活性。將濃縮的周質(zhì)提取物進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，顯示在32 kDa處有一蛋白條帶產(chǎn)生。將表達(dá)產(chǎn)物純化后進(jìn)行 SDS-PAGE 顯示，在32 kDa同樣有一蛋白條帶產(chǎn)生。為了進(jìn)一步驗(yàn)證表達(dá)的蛋白即目的蛋白，將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了Western blot雜交，結(jié)果顯示，與純化后的電泳結(jié)果一致，在32 kDa處有單一的條帶產(chǎn)生，說(shuō)明表達(dá)純化的蛋白即目的蛋白。 ⑦將篩選的抗原陽(yáng)性單鏈抗體進(jìn)行了

14、特性研究。單鏈抗體(GX95、GX44、 GX13)特異性強(qiáng)、親和力高。其與柑橘潰瘍病菌近源種 Xanthomonas．oryzae pv． oryzae (Xooc)；Xanthomonas．campestris pv．campestri(Xcc)；Xanthomonas．oryzae pv． oryzicola (Xoc)；及從柑橘葉片上分離的 10 種腐生黃單孢菌及 Bacillus subtilis；E. coli 都沒(méi)有交叉反

15、應(yīng)。Biacore 分析其親和力表明，單鏈抗體GX95、GX44和 GX13的親和常數(shù)分別為1.98x10<'10>M<'-1>、1.89×10<'10>M<'-1>、3.43x10<'10>M<'-1>。 ⑧對(duì)篩選的單鏈抗體進(jìn)行了測(cè)序。用DNAplot軟件分析單鏈抗體序列，結(jié)果表明：?jiǎn)捂溈贵wGX44和GX13重鏈分別屬于VH1基因家簇，GX95 重鏈屬于VH3基因家簇；GX44和GX13輕鏈屬于Vk Ⅳ亞基因家簇，GX95輕鏈