靶向MIF的siRNA對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景：巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(Macrophage Migration Inhibitory Factor，MIF)具有信號(hào)調(diào)節(jié)、免疫活性、促進(jìn)炎癥反應(yīng)、催化功能以及內(nèi)分泌功能等多種生物學(xué)功能。它還可以刺激細(xì)胞增殖、分化、遷移，促進(jìn)腫瘤血管生成，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中擔(dān)任重要角色。
　　 MIFsiRNA (the small interfering RNA of macrophage migration inhibitory

2、 factor)是一種化學(xué)合成的MIF的特異性siRNA，它能夠與MIF的mRNA 同源序列特異性的結(jié)合，導(dǎo)致MIF的mRNA序列分解，MIF蛋白的翻譯受到抑制，從而抑制MIF的生物學(xué)功能。因此，我們推測(cè)MIFsiRNA 可以抑制大腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲，增加細(xì)胞的凋亡。
　　 目的：研究化學(xué)合成的MIFsiRNA 對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并探討其可能的機(jī)制，為防治大腸癌開辟新的途徑。
　　 方法：
　　 1

3、.熒光的實(shí)驗(yàn)組用100 nM/ml 濃度的FAMsiRNA 轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞，空白對(duì)照組不添加任何siRNA 進(jìn)行處理。
　　 2.陽性對(duì)照組用10～100 nM/ml 濃度的MIFsiRNA 轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞，陰性對(duì)照組用10～100 nM/ml 非特異性的siRNA 轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞，空白對(duì)照組不添加任何siRNA 進(jìn)行處理。
　　 3.RT-PCR檢測(cè)MIFsiRNA組、非特異性的siRNA組和空白對(duì)照組轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞后

4、MIF、CD74、Caspases3、Caspases8、E-Cadh erin、Tiam1在mRNA 水平上的表達(dá)量。
　　 4.MTT 法觀察MIFsiRNA、非特異性的siRNA和空白組對(duì)大腸癌CT-26 細(xì)胞增殖的影響。
　　 5.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)MIFsiRNA和非特異性的siRNA 轉(zhuǎn)染CT-26細(xì)胞后培養(yǎng)液中MIF蛋白的表達(dá)量。
　　 6.微孔遷移法檢測(cè)MIFsiRNA和非特異性的s

5、iRNA 對(duì)CT-26 細(xì)胞體外侵襲的影響。
　　 7.流式細(xì)胞儀檢測(cè)MIFsiRNA和非特異性的siRNA 對(duì)CT-26 細(xì)胞凋亡的影響。
　　 8.Western blot檢測(cè)MIFsiRNA和非特異性的siRNA 對(duì)細(xì)胞內(nèi)MIF、CD74、Caspases8蛋白表達(dá)量的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.熒光siRNA 轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)。
　　 2.MIFsiRNA 抑制了CT-26 細(xì)胞的增殖，呈

6、時(shí)間-劑量依賴性,非特異性的siRNA與空白組對(duì)CT-26 細(xì)胞沒有影響。
　　 3.100 nM/ml MIFsiRNA 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞表達(dá)MIF、CD74、Tiam1 量下降，E-Cadh erin、Caspases3、Caspases8 表達(dá)量升高，與非特異性的siRNA 及空白組比較有顯著差異，空白組與非特異性的siRNA 比較無差異。
　　 4.100 nM/ml MIFsiRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后，外分泌MIF

7、蛋白的表達(dá)降低，空白組與非特異性的siRNA 對(duì)外分泌MIF蛋白的表達(dá)無影響。
　　 5.100 n M/ml MIFsiRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞穿透聚碳酸酯膜顯著減少，與非特異性的siRNA 及空白組比較有顯著差異，空白組與非特異性的siRNA 比較無差異。
　　 6.100 nM/ml MIFsiRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞凋亡增加，較非特異性的siRNA及空白組有顯著差異，空白組與非特異性的siRNA

8、無差異7、100 n M/ml MIFsiRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)MIF、CD74蛋白表達(dá)下降，Caspases8蛋白表達(dá)上調(diào)，與非特異性的siRNA 及空白組比較有顯著差異，但非特異性的siRNA與空白組比較無差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.MIFsiRNA 抑制了大腸癌細(xì)胞CT-26的增殖，其機(jī)制可能為MIFsiRNA 降低了MIF與CD74的結(jié)合，下調(diào)MEK/ERK 途徑，細(xì)胞增殖下降。
　　 2