鉛誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮氧化應(yīng)激應(yīng)答機(jī)制及其細(xì)胞生物學(xué)特征.pdf

1、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium, RPE)是位于神經(jīng)視網(wǎng)膜與脈絡(luò)膜血管層之間一單層細(xì)胞,由神經(jīng)外胚層分化而來(lái)。正常的 RPE層對(duì)于視細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能的維持以及視周期的順利進(jìn)行起著極為關(guān)鍵的作用。當(dāng)RPE發(fā)生病變,會(huì)引起一系列視網(wǎng)膜疾病。目前就 RPE發(fā)生病變的機(jī)制并未完全闡明,但這些視網(wǎng)膜病變疾病通常都伴隨有 RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激(oxidative stress)的發(fā)生。這成為了視網(wǎng)膜病變相

2、關(guān)疾病機(jī)制研究的一個(gè)重要突破口。目前已經(jīng)知道誘發(fā) RPE產(chǎn)生氧化應(yīng)激的因素主要有超氧陰離子自由基、藍(lán)光輻射、致毒性物質(zhì)的攝入、吸煙、肥胖等等。有研究發(fā)現(xiàn)重金屬鉛經(jīng)個(gè)體吸收后在體內(nèi)會(huì)誘發(fā)某些細(xì)胞或組織產(chǎn)生自由基,這些成分會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激應(yīng)答并嚴(yán)重干擾細(xì)胞內(nèi)環(huán)境還原穩(wěn)態(tài)。此外,早年有報(bào)道發(fā)現(xiàn)重金屬鉛、鎘在眼底會(huì)發(fā)生沉著,而且在 RPE層蓄積明顯。因此,我們懷疑慢性鉛暴露是否也是誘發(fā) RPE產(chǎn)生氧化應(yīng)激并進(jìn)一步導(dǎo)致其發(fā)生病變的潛在

3、病因?qū)W因素。
　　本課題主要以本實(shí)驗(yàn)室建立的胎兒 RPE細(xì)胞系 fRPE-13及當(dāng)下常用 RPE系A(chǔ)RPE19作為主要的實(shí)驗(yàn)材料,RPE經(jīng)不同濃度梯度鉛染培養(yǎng)后,通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、鑒定氧化應(yīng)激相關(guān)通路的分子表達(dá)差異以及對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮生理學(xué)功能的測(cè)定與評(píng)價(jià),來(lái)確認(rèn)重金屬鉛是否也是誘發(fā)視網(wǎng)膜色素上皮氧化損傷的一個(gè)重要病理學(xué)因素。研究結(jié)果小結(jié)如下:
　　1、急性染鉛培養(yǎng)72 hr,用 CCK-8法測(cè)定在各個(gè)鉛劑量組 RPE

4、細(xì)胞活率。結(jié)果顯示,無(wú)論是胎兒來(lái)源的 fRPE-13還是成年來(lái)源的 ARPE-19,都存在低劑量鉛(≤20μM)興奮性效應(yīng);而劑量高于50μM時(shí),RPE細(xì)胞活率下降顯著;此外,RPE對(duì)鉛的可耐受性高于以往研究的其他類(lèi)型細(xì)胞。我們并且由此確定了后續(xù)實(shí)驗(yàn)鉛的考察劑量:0μM、10μM、50μM、250μM。
　　2、RPE細(xì)胞經(jīng)間隔12 hr連續(xù)的慢性染鉛培養(yǎng)3天、5天、8天,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化。鉛染培養(yǎng)3天,0μM與10μM組細(xì)胞

5、飽滿生長(zhǎng)旺盛,呈眾小島樣,50μM、250μM組呈小島樣細(xì)胞相對(duì)較少,長(zhǎng)勢(shì)緩慢;染鉛培養(yǎng)5天后, fRPE-13的10μM組培養(yǎng)皿外圍細(xì)胞已開(kāi)始皺縮;ARPE-19的50μM組細(xì)胞則成狹長(zhǎng)彎鉤狀,而250μM組已經(jīng)完全成皺縮樣;當(dāng)染鉛培養(yǎng)8天后,fRPE-13中10μM組則大范圍開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞皺縮,而 ARPE-19的10μM組細(xì)胞也出現(xiàn)鵝卵石樣上皮,但是細(xì)胞形態(tài)大小不一且不規(guī)整;50μM組與250μM組細(xì)胞則已經(jīng)完全皺縮。
　　3

6、、細(xì)胞滿板后,劃痕,并連續(xù)鉛染培養(yǎng)3天,間隔一定時(shí)間在光鏡下記錄細(xì)胞遷移情況。采用計(jì)算空白區(qū)像素大小的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明,當(dāng)鉛濃度達(dá)到50μM,無(wú)論是 fRPE-13還是 ARPEA19,上皮的遷移能力幾乎完全受到了抑制;而即使是低濃度鉛(10μM)也會(huì)降低 RPE細(xì)胞的劃痕愈合能力,這種對(duì)上皮創(chuàng)傷愈合能力的抑制作用呈劑量依賴特征。
　　4、細(xì)胞經(jīng)慢性鉛染培養(yǎng)5天后,收集并重新鋪入96孔板中連續(xù)培養(yǎng)7天,采用 CCK-8

7、法每隔24 hr測(cè)定其細(xì)胞活率,并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示生長(zhǎng)曲線右移,表明鉛降低了 RPE的增值活性。
　　5、依據(jù) RPE細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的特點(diǎn),當(dāng)染鉛或無(wú)鉛培養(yǎng)3.5天后達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,收集細(xì)胞進(jìn)行固定、PI染色并進(jìn)行流式周期分析。結(jié)果表明,與不染鉛組相比,低劑量(10μM)染鉛組進(jìn)入 S與 G2M期細(xì)胞明顯增多,這進(jìn)一步印證了低劑量鉛的興奮性效應(yīng);而隨著鉛濃度高于50μM,進(jìn)入分裂相的細(xì)胞開(kāi)始減少。
　　6、RPE細(xì)胞

8、經(jīng)慢性鉛染培養(yǎng)5天,Trizol法提取總 RNA,逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA后進(jìn)行 qPCR檢測(cè)。結(jié)果表明鉛能夠誘導(dǎo)分子伴侶(如抗增值蛋白、HSP70)、抗氧化蛋白與酶均表達(dá)上調(diào)等一系列氧化應(yīng)激應(yīng)答成員的高表達(dá)。此外,氧化應(yīng)激應(yīng)答關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 Nrf2的表達(dá)也發(fā)生顯著上調(diào)。
　　7、RPE細(xì)胞經(jīng)慢性鉛染培養(yǎng)5天,收集貼壁或未貼壁細(xì)胞進(jìn)行流式凋亡分析。結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率呈鉛劑量依賴性特征。
　　綜上所述,從 RPE細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生理