池蝶蚌性別決定相關(guān)基因feminization-1基因的分子特征及表達(dá)分析.pdf

1、本課題采用 Smart Race-PCR技術(shù)及巢氏 PCR技術(shù)從淡水貝類池蝶蚌中克隆到兩個(gè)與性別決定相關(guān)的基因 feminization-1基因的 b、c兩個(gè)亞型(Hsfem-1b、Hsfem-1c)的 cDNA全長(zhǎng)序列。
　　Hsfem-1b基因的 cDNA序列全長(zhǎng)為2072bp,其中5’ UTR(非編碼區(qū))長(zhǎng)度為50bp,3’ UTR長(zhǎng)度為114bp,具有28bp長(zhǎng)的 polyA尾及加尾信號(hào)ATTAAA;開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)

2、度為1908bp,編碼635個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì);無信號(hào)肽,預(yù)測(cè)其分子量約為71.54kDa,理論等電點(diǎn)為6.05kD;HsFem-1b蛋白氨基酸序列 C端存在一段高度保守序列:Pro-X-X-Leu-X-X-Phe-X-X-X-His(X為隨機(jī)氨基酸);SMART蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn) Hsfem-1b基因編碼蛋白的功能域包含8個(gè) ANK(Ankyrin repeat motif)錨蛋白重復(fù)序列,并且運(yùn)用 SWISS-MODEL Workspa

3、ce預(yù)測(cè) HsFem-1b蛋白的三維結(jié)構(gòu),與 SMART預(yù)測(cè)結(jié)果一致,能清楚的看到8個(gè) ANK模體。
　　Hsfem-1c基因的 cDNA序列全長(zhǎng)為2328bp,其中5’ UTR(非編碼區(qū))長(zhǎng)度為137bp,3’ UTR長(zhǎng)度為322bp,具有 polyA尾及加尾信號(hào) AATAAA;開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為1869bp,編碼622個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì);無信號(hào)肽,預(yù)測(cè)其分子量約為69.95kDa,理論等電點(diǎn)為7.05kD;HsFem

4、-1c蛋白氨基酸序列 C端同樣也存在一段高度保守序列:Pro-X-X-Leu-X-X-Phe-X-X-X-His(X為隨機(jī)氨基酸);SMART蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn) Hsfem-1c基因編碼蛋白的功能域包含9個(gè) ANK(Ankyrin repeat motif)錨蛋白重復(fù)序列,并且運(yùn)用 SWISS-MODEL Workspace預(yù)測(cè) HsFem-1c蛋白的三維結(jié)構(gòu),與 SMART預(yù)測(cè)結(jié)果一致,能清楚的看到9個(gè) ANK模體。
　　利用 Q-P

5、CR技術(shù)檢測(cè)池蝶蚌不同組織 Hsfem-1b和 Hsfem-1c基因的 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果表明:Hsfem-1b和 Hsfem-1c基因的 mRNA表達(dá)均存在明顯的組織差異性。Hsfem-1b和 Hsfem-1c基因都是在精巢組織中表達(dá)量最高,分別是腎臟的72.35倍、77.87倍。在肝胰腺、腸、卵巢中的表達(dá)量次之,在血淋巴、外套膜、鰓和閉殼肌中的表達(dá)量較低,腎臟中表達(dá)量最低。分析不同年齡層次池蝶蚌精巢中 Hsfem-1b和 Hsf

6、em-1c的 mRNA表達(dá),發(fā)現(xiàn) Hsfem-1b和 Hsfem-1c基因隨著精巢的發(fā)育,它們的表達(dá)水平變化趨勢(shì)也不一樣。隨著性腺的成熟和精子的發(fā)生,Hsfem-1b基因的表達(dá)逐漸增強(qiáng),說明它在池蝶蚌精子的發(fā)生或性腺發(fā)育的過程中具有重要的作用。Hsfem-1c基因在2齡池蝶蚌精巢中的表達(dá)量顯著提高,是1齡的6.77倍;然而,在3~4齡時(shí)表達(dá)水平反而回落,至5齡時(shí),表達(dá)水平又顯著上升至1齡的7.67倍,與2齡表達(dá)水平相平。池蝶蚌在2齡時(shí)性

7、腺細(xì)胞向精原細(xì)胞或卵原細(xì)胞方向發(fā)育,說明 Hsfem-1c基因可能參與池蝶蚌性腺細(xì)胞雄性性別分化的過程,并且可能與精子的發(fā)生有關(guān)。
　　通過雙酶切連接,構(gòu)建 pET32-HsFem-1b和 pET32-HsFem-1c原核表達(dá)載體,將測(cè)序正確的重組原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 Ecoi.li(DE3),IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)了兩種融合蛋白。HsFem-1b重組蛋白以包涵體的形式存在,通過變性劑尿素溶解包涵體,梯度稀釋法復(fù)性后根據(jù) Ni2+螯和

8、層析法原理純化出單一的目的蛋白。HsFem-1c蛋白主要以可溶性蛋白形式存在,直接通過鎳柱純化獲得單一的目的蛋白。
　　利用純化的重組 HsFem-1c蛋白制備兔多抗隆抗體,Elisa測(cè)出其血清抗體效價(jià)在512000以上,說明獲得了較高效價(jià)的兔抗體血清。經(jīng) Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組 HsFem-1c蛋白可以與兔抗體血清特異性地結(jié)合。根據(jù)熒光抗體原理,通過制作冰凍切片,并利用獲得的兔多抗血清在性腺細(xì)胞中定位 Hs