Notch1對PC12細胞自噬和生物學特性的影響.pdf

1、Notch基因在無脊椎動物和脊椎動物中都廣泛存在且高度表達，并且在不同物種間都具有高度的進化保守性。Notch信號通路的功能復雜多樣，調控正常細胞的生長分化，決定細胞的命運，參與調控細胞生命活動的方方面面，在哺乳類動物中，Notch參與造血、T細胞發(fā)育、血管生成等重要生理過程，并與腫瘤形成和某些神經系統(tǒng)疾病有密切關系。本實驗室采用Tet-on基因表達系統(tǒng)，建立了可動態(tài)調控NICD基因表達的PC12-Notch1細胞系，克服了傳統(tǒng)研究方法

2、不能準確調控細胞內Notch1表達的缺點，有利于更好的研究Notch1對PC12細胞的作用以及其中的分子機制。自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用，且已有研究表明Notch與自噬的信號調控有關。本實驗旨在PC12-Notch1細胞系的基礎上研究PC12細胞內Notch1基因對細胞內自噬和細胞生物學特性的影響及PI3K-AKT-MTOR通路mRNA的變化，探討可能的調控機制。
　　目的：
　　四環(huán)素衍生物強力霉素(DOX)動態(tài)調

3、控Tet-on基因表達系統(tǒng)PC12-Notch1細胞中Notch1胞內段(NICD)的表達，檢測在Notch1不同的表達水平上PC12細胞增殖、凋亡和細胞內自噬水平的變化。研究Notch1基因對細胞內自噬和細胞生物學特的影響及PI3K-AKT-MTOR通路mRNA的變化，探討其可能的調控機制。
　　方法：
　　1.檢測PC12-Notch1細胞內NICD的表達:復蘇PC12-Notch1細胞，取兩代之后的細胞接種六孔板，加入

4、四環(huán)素DOX(1ug/ml)誘導細胞內NICD的表達。根據(jù)DOX誘導時間分為六各不同時間組(分別是0h，12h，24h，36h，48h，60h)。熒光倒置顯微鏡下觀察不同誘導時間組內細胞生長形態(tài)和細胞內綠色熒光蛋白EGFP的表達，每孔計數(shù)三個視野內的EGFP陽性表達率，最后計算平均值，得出各誘導時間組EGFP陽性細胞百分比。消化各組細胞，上流式細胞儀測量各組細胞內NICD的熒光表達強度，繪制DOX不同誘導時間點PC12-notch1細胞

5、內NICD表達趨勢圖。
　　2.檢測高表達NICD的PC12-Notch1細胞周期和凋亡:將PC12-Notch1細胞接種六孔板，加入四環(huán)素DOX（1ug/ml）誘導NICD的表達，仍舊根據(jù)DOX誘導時間分為六各不同時間組（分別是0h，12h，24h，36h，48h，60h）。消化各時間組的細胞，上流式儀測量各時間組NICD不同的表達水平上細胞內周期及凋亡率的變化。
　　3.PC12-Notch1細胞自噬的檢測:消化各時間組

6、的細胞并提取蛋白質，Westernblot檢測自噬標志蛋白LC3B，Beclin1，ATG7，ATG5的表達。軟件分析曝光條帶灰度值并比較各時間組細胞內自噬蛋白的表達差異。
　　4.熒光定量PCR檢測PC12-Notch1細胞內自噬信號通路:提取各時間組細胞內RNA，將RNA反轉錄成cDNA，熒光定量PCR檢測PI3K、AKT、mTOR等基因的表達，比較在不同分組間mRNA表達差異。
　　結果：
　　1.熒光表達量:加

7、入DOX誘導后，在顯微鏡下觀察PC12-Notch1內綠色熒光蛋白的表達量和流式細胞儀檢測熒光強度，發(fā)現(xiàn)0h組細胞未觀察到綠色熒光，隨著誘導時間的增加，從12h組，24h組再到36h組細胞中綠色熒光蛋白表達量逐漸增加，細胞熒光表達率分別為20％，55％，71％。在誘導36h時熒光表達強度和熒光表達率達到最高，之后再持續(xù)給藥誘導48h，60h時發(fā)現(xiàn)NICD熒光表達率和表達強度有所下降，但都高于0h組，熒光表達率分別為63％，59％。各誘導

8、時間組細胞內NICD的熒光強度都顯著高于非誘導組。
　　2.細胞周期和凋亡:在PC12-Notch1 DOX非誘導細胞組中，細胞的凋亡率維持較低水平。隨著誘導時間的增加直到最大誘導時間60h組，PC12-Notch1細胞凋亡率是逐漸升高的，60h時凋亡率達到最高，統(tǒng)計分析各誘導組與非誘導組相比都具有顯著向差異。在PC12-Notch1 DOX非誘導組細胞中，細胞的S期較高。從0h組開始隨著誘導時間的增加直到最大誘導時間60h組，P

9、C12-Notch1細胞周期中S期逐漸降低，60h組S期達到最低。
　　3.細胞自噬水平的變化:Westernblot檢測各時間組細胞內自噬標志蛋LC3B，Beclin1，ATG7，ATG5的表達。應用軟件Image對曝光條帶灰度值分析得出這四種自噬蛋白的表達量先隨DOX誘導時間增加而升高到36h達到最高，說明此時細胞自噬水平達到高峰，之后再持續(xù)誘導48h，60h時發(fā)現(xiàn)灰度值呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，但都高于0h組;方差分析得，各誘導時間

10、組細胞內LC3B，Beclin1，ATG7，ATG5的表達量都顯著高于非誘導組。
　　4.熒光定量PCR檢測DOX不同誘導時間組PC12細胞內基因PI3K、AKT、mTOR、GADPH的表達。分析結果可得:各個實驗組細胞內PI3K、AKT、mTOR的表達比非誘導組明顯降低，且具有顯著差異(P＜0.01)。
　　結論:
　　1.利用強力霉素(DOX)動態(tài)調控Tet-on基因表達系統(tǒng)PC12-Notch1胞中Notch1胞