磁性納米殼聚糖微球的制備及其固定化酵母細(xì)胞的研究.pdf

1、磁性高分子微球是指通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ褂袡C(jī)高分子與無機(jī)磁性物質(zhì)結(jié)合起來形成具有一定磁性和特殊結(jié)構(gòu)的微球。它除了具有磁性還具有高分子的特性，微球表面能引入多種活性基團(tuán)來結(jié)合酶、細(xì)胞、抗體等生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞快速分離、酶/細(xì)胞固定、靶向藥物等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。固定化技術(shù)由于能保持酶/細(xì)胞的活性和重復(fù)利用等特點(diǎn)而倍受眾多研究者的關(guān)注。固定化過程的關(guān)鍵因素是固定化載體設(shè)計(jì)和制備以及固定化方法的選擇。光學(xué)活性的扁桃酸是一種多用途的手性試劑，同

2、時(shí)又是合成青霉素和頭孢菌素的藥物中間體。因此，制備手性扁桃酸成為合成化學(xué)中一個(gè)富有挑戰(zhàn)性的目標(biāo)。而采用酵母細(xì)胞生物催化制備手性扁桃酸，因其具有高效率，高立體選擇性，反應(yīng)條件溫和以及經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益好等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞。 基于此，本論文主要以面包酵母為生物催化劑，選擇合適的固定化載體和固定化方法固定酵母微生物，生物催化合成(R)-扁桃酸。以磁性納米Fe3O4為核，通過殼聚糖(CTS)和α-酮戊二酸縮殼聚糖(KCTS)的包覆，合成了兩種

3、納米磁性殼聚糖高分子微球，并將殼聚糖和合成的磁性殼聚糖高分子微球作為固定化酵母醇脫氫酶(Saccharomvces cerevisiae alcohol dehydrogenase (SCAD))和酵母細(xì)胞的載體，進(jìn)而作為生物催化劑催化潛手性底物苯乙酮酸合成(R)-扁桃酸。主要研究工作如下： 采用氧化水熱法，以H2O2為氧化劑制備了納米Fe3O4顆粒，并對(duì)Fe3O4顆粒表面進(jìn)行改性。以磁性Fe3O4為核，通過反相懸浮交聯(lián)法，與C

4、TS聚合制備了表面含有氨基的磁性Fe3O4/CTS納米粒子。以磁性Fe3O4為核，在碳二亞胺的活化作用下，通過反相懸浮交聯(lián)法與KCTS反應(yīng)制備了表面含有羧基的磁性Fe3O4/KCTS納米粒子。經(jīng)XRD、TEM、VSM、IR、TGA等手段對(duì)復(fù)合材料進(jìn)行了表征。結(jié)果表明：氧化水熱法制備的Fe3O4粒子具有尖晶石型結(jié)構(gòu)，平均粒徑為23 nm；磁性Fe3O4/CTS粒子平均粒徑為35 nm，其飽和磁化強(qiáng)度為21.5 emu·g-1；磁性Fe3O

5、4/KCTS微球的平均粒徑為26nm左右，比飽和磁化強(qiáng)度為24.8emu·g-1；此兩種磁性復(fù)合納米粒子具有超順磁性和良好的磁分離效果。 以苯乙酮為起始原料，經(jīng)亞硝化、水解和氧化得潛手性底物苯乙酮酸。此方法縮短了反應(yīng)步驟，操作簡單，收率為57.5％。同時(shí)研究了一種快速定量分析發(fā)酵液中苯乙酮酸的方法，即在氫氧化鈉的水溶液中，苯乙酮酸和2,4-二硝基苯肼在堿性條件下形成一種紅棕色的溶液，該溶液在458 nm處有最大吸收。苯乙酮酸的量

6、在0.01-0.05mmol/L范圍內(nèi)符合朗伯-比耳定律，回歸方程 Y=13.512X-0.01212.R=0.9994。故可以用它快速檢測(cè)發(fā)酵液中苯乙酮酸的消耗量，從而可以迅速了解反應(yīng)進(jìn)程。 以釀酒酵母為研究對(duì)象，通過增殖培養(yǎng)、超聲波破碎酵母菌細(xì)胞獲得SCAD。采用溶脹-吸附法，將SCAD在25℃，吸附在磁性納米Fe3O4/KCTS粒子，固定60 min，此時(shí)SCAD的吸附率為24.87％。以苯乙酮酸為底物，對(duì)磁性納米Fe3O

7、4/KCTS粒子固定化SCAD的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。固定化酶的最適溫度為20℃，最佳反應(yīng)pH值是7.4，固定化酶具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，在70℃保溫1h保持53.5％的酶活力；在pH6.4-8.0之間均能保持最大活力的80％以上。 利用吸附體系研究了SCAD與磁性納米Fe3O4/CTS載體的吸附行為，評(píng)價(jià)了SCAD在磁性納米Fe3O4/CTS載體上的吸附能力，探討了磁性納米Fe3O4/CTS載體對(duì)SCAD的吸附動(dòng)力學(xué)和熱

8、力學(xué)行為。磁性納米Fe3O4/CTS載體對(duì)SCAD的吸附在所研究的SCAD濃度范圍內(nèi)符合Freundlich模型。磁性納米Fe3O4/CTS載體對(duì)SCAD吸附反應(yīng)符合Lagergren一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，在293K時(shí)，速率常數(shù)k為0.01254 min-1。吸附表觀活化能Ea為27.62kJ·mol-1，活化能比較低，表明納米Fe3O4/CTS載體對(duì)SCAD的吸附較容易。在起始酶液濃度為0.1435-0.9162mg·ml-1范圍內(nèi)，Δ

9、H為正值，表明這是一個(gè)吸熱反應(yīng)，升高溫度有利于吸附的進(jìn)行。以苯乙酮酸為底物，對(duì)磁性納米Fe3O4/CTS粒子固定化SCAD的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。固定化酶的最適溫度為40℃，最佳反應(yīng)pH值是7.4，固定化酶具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。磁性酶因具有磁響應(yīng)性，可方便、快速地從反應(yīng)體系中分離。 SCAD以NADH為輔酶催化苯乙酮酸轉(zhuǎn)化為(R)-扁桃酸的反應(yīng)屬于雙底物酶促反應(yīng)，遵循有序反應(yīng)機(jī)理。反應(yīng)機(jī)理是：輔酶分子A(NADH)先進(jìn)入

10、酶的輔酶結(jié)合部位，形成EA后底物苯乙酮酸B再進(jìn)入底物結(jié)合部位，形成三元活性配合物EAB，完成氧化還原反應(yīng)變成EPQ配合物，再按順序釋出產(chǎn)物P((R)-扁桃酸)和還原形式的輔酶Q(NAD+)。按King-Altman處理方式，在不考慮其它成分的抑制作用，得到了一個(gè)簡化的酶促動(dòng)力學(xué)方程。 v=Vmax[S]/Km+[S]利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法，研究了磁性納米Fe3O4/CTS粒子固定化SCAD和納米Fe3O4/K

11、CTS粒子固定化SCAD的酶促動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax。 以戊二醛為交聯(lián)劑，將殼聚糖球交聯(lián)引入醛基，然后將交聯(lián)的殼聚糖球浸泡在酵母細(xì)胞懸浮液中，制備了固定化酵母細(xì)胞殼聚糖球。以苯乙酮酸為底物，催化合成了(R)-扁桃酸。最優(yōu)固定化條件是戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w(GA)為1％，酵母細(xì)胞與交聯(lián)殼聚糖球的質(zhì)量比(m(Y)：m(CB))為0.5:1，交聯(lián)時(shí)間為6h，固定化時(shí)間為18h，底物濃度為10 mmol·L-1，在此條件下反應(yīng)最大轉(zhuǎn)化率和

12、產(chǎn)物光學(xué)純度分別高達(dá)67.86％和98.05％e.e.。固定化酵母殼聚糖球具有良好的重復(fù)使用性和貯存穩(wěn)定性。 利用磁性納米Fe3O4/CTS微球作載體固定化酵母細(xì)胞，酵母細(xì)胞主要以吸附的形式固定在磁性殼聚糖上面，形成磁性固定化酵母細(xì)胞。在溫度為30℃，時(shí)間為2h，磁性殼聚糖與菌泥質(zhì)量配比為2:1時(shí)，酵母細(xì)胞吸附率可達(dá)17.2％。磁性固定化酵母細(xì)胞催化苯乙酮酸合成(R)-扁桃酸的最佳溫度為30℃，時(shí)間為11h，底物苯乙酮酸的最佳濃