上調(diào)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1A生物學(xué)功能的影響.pdf

1、背景與目的
　　近些年來子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)病率逐年上升。肥胖，高血壓，糖尿病和血脂異常的多種危險(xiǎn)因素共同構(gòu)成的代謝綜合征與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)病密切相關(guān)。而胰島素抵抗是代謝綜合征的中心環(huán)節(jié)。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(insulinlikegrowthfactorbindingproteins，IGFBPs)是胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-likegrowthfactor，IGF)體系中的重要成員，其中包括與IGF有較高的結(jié)合能力的I

2、GFBP1-6，及新近發(fā)現(xiàn)的與胰島素有較高結(jié)合能力的IGFBP7-15，又被稱為胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白(insulinlikegrowthfactorbindingprotein-relatedprotein，IGFBP-rP)，其中研究最多最重要的是1GFBP-rP1，與IGFBP1-6相比，1GFBP-rP1與IGF1和IGF2的結(jié)合能力分別要弱5倍和20-25倍，但與胰島素的結(jié)合能力要強(qiáng)500倍。胰島素和IGFBP-rP

3、1結(jié)合后使胰島素降低或喪失正常生理作用，導(dǎo)致機(jī)體胰島素敏感性下降，引起胰島素抵抗，從而參與一些惡性腫瘤如結(jié)腸癌、乳腺癌等的發(fā)生發(fā)展，并且高胰島素血癥和低IGFBP-rP1水平是子宮內(nèi)膜癌的高危因素。但是1GFBP-rP1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞發(fā)揮何種作用尚不清楚，因此，本研究應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法將重組質(zhì)粒pEX-2-IGFBP-rP1轉(zhuǎn)染1GFBP-rP1低表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1A，觀察上調(diào)1GFBP-rP1對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞

4、系HEC-1A的增殖速率，凋亡及細(xì)胞周期的影響，探討1GFBP-rP1在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮的具體作用。
　　方法
　　1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染:應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1A，分為三組:轉(zhuǎn)染pEX-2-IGFBP-rP1組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、空白對(duì)照組（僅轉(zhuǎn)染試劑），并用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率;
　　2.應(yīng)用QRT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中IGFBP-rP1的RNA表達(dá);
　　3.應(yīng)用蛋白印

5、跡法(WesternBlot)測(cè)定各組細(xì)胞IGFBP-rP1蛋白表達(dá);
　　4.應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法分別檢測(cè)各組細(xì)胞24h、48h、72h增殖抑制率;
　　5.采用流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用AnnexinV-APC/PI雙染法測(cè)定各組細(xì)胞的凋亡率。采用PI單染法測(cè)定各組細(xì)胞的細(xì)胞周期;
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所得結(jié)果以(X)±s表示。采用重復(fù)測(cè)量的方差分析來比較各組細(xì)胞的增殖抑制

6、率，用單因素方差分析比較各組細(xì)胞的mRNA，蛋白表達(dá)，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期，兩兩比較采用LSD法。
　　結(jié)果
　　1.轉(zhuǎn)染pEX-2-IGFBP-rP1組IGFBP-rP1mRNA的相對(duì)拷貝量為:2.699±0.293，蛋白相對(duì)表達(dá)量為:1.126±0.074與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(1.296±0.169，0.889±0.040)及空白對(duì)照組(1.031±0.301，0.884±0.043)相比明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.

7、01）;
　　2.轉(zhuǎn)染pEX-2-IGFBP-rP1組24h，48h，72h增殖抑制率分別為:(37.3±5.4)％、(39.9±4.7)％、(38.0±5.3)％，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(3.6±0.6)％，(4.0±0.5)％，(3.3±0.6)％和空白對(duì)照組(2.7±0.3)％，(3.2±0.2)％，(2.4±0.2)％相比，增殖抑制率明顯上升，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01）;
　　3.轉(zhuǎn)染后48h，轉(zhuǎn)染pEX-2-IG

8、FBP-rP1組凋亡率為(20.667±2.055)％，明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(3.967±0.351)％及空白對(duì)照組(4.967±0.252)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);
　　4.轉(zhuǎn)染pEX-2-IGFBP-rP1組S+G2/M期細(xì)胞的比例為:(30.980±1.461)％，明顯低于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(38.797±2.419)％和空白對(duì)照組(37.800±0.350)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　結(jié)論