三種美白劑對(duì)B16細(xì)胞黑素合成影響的研究.pdf

1、目的：黑色素對(duì)于防止皮膚受到紫外線輻射損傷具有重要作用，但是當(dāng)皮膚局部黑素生成過多或分布不均，就會(huì)出現(xiàn)各種色素沉著性疾病，如黃褐斑，雀斑，脂溢性角化斑以及炎癥后色素沉著等，影響美觀。部分傳統(tǒng)美白藥物的機(jī)理功效以及對(duì)黑素細(xì)胞的毒性還不明確，與一些新穎的天然提取美白成分尚缺乏明確的比較和分析。本研究通過比較觀察熊果苷，甘草黃酮及新型內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)體外培養(yǎng)B16鼠黑素瘤細(xì)胞黑素生成的影響，探討黑素合成機(jī)制，評(píng)估藥物安全性，為新一代美白藥物的研

2、發(fā)提供理論思路和實(shí)踐方向。 方法：實(shí)驗(yàn)使用B16小鼠黑素瘤細(xì)胞株（B16 cell）作為試驗(yàn)對(duì)象。在第一部分，取對(duì)數(shù)生長期的B16細(xì)胞，選擇31.25、62.5、125、250、500μg/ml5種濃度的熊果苷，甘草黃酮和內(nèi)皮素拮抗劑作用72小時(shí)后，觀察細(xì)胞大體形態(tài)變化，用MTT法檢測三種藥物對(duì)B16細(xì)胞增殖率的影響，比較藥物的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)第二部分，收獲系列濃度梯度的三種藥物處理后的B16細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)后，分別測

3、定細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑素含量。實(shí)驗(yàn)第三部分，選擇0.5μg/ml內(nèi)皮素，200μg/ml內(nèi)皮素拮抗劑作用于細(xì)胞，以熊果苷為對(duì)照，觀察內(nèi)皮素對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞增殖的影響，檢測細(xì)胞酪氨酸酶活性的變化，同時(shí)與內(nèi)皮素拮抗劑組作比較，觀察內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)內(nèi)皮素的特異性拮抗作用。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)第一部分的結(jié)果顯示：甘草黃酮及熊果苷均能抑制細(xì)胞增殖，125μg/ml甘草黃酮作用48h，可見細(xì)胞分布稀疏，數(shù)量減少，增殖分化受到明顯抑制，內(nèi)皮素拮抗劑

4、與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞形態(tài)無特殊變化。用MTT比色法分別檢測31.25、62.5、125、250和500μg/ml5種濃度甘草黃酮，熊果苷和內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)體外培養(yǎng)B16細(xì)胞增殖率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘草黃酮隨藥物濃度的增加，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用增加，甘草黃酮濃度在500μg/ml時(shí)，由于細(xì)胞毒性強(qiáng)，24h換液時(shí)，細(xì)胞全部脫落死亡。熊果苷濃度超過250μg/ml呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖抑制。31.25~500μg/ml內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)細(xì)胞增殖率無明

5、顯抑制作用(p>0.05)。實(shí)驗(yàn)第二部分的結(jié)果顯示：甘草黃酮能夠顯著抑制酪氨酸酶活性和黑素合成，且呈濃度依賴性，與空白對(duì)照組相比較，濃度為31.25、62.5、125、250μg/ml的甘草黃酮作用72小時(shí)后，B16細(xì)胞酪氨酸酶活性分別為78.41％、69.04％、52.13％、39.01％，黑素含量分別為81.70％、67.42％、58.39％、46.25％，甘草黃酮濃度在500μg/ml時(shí)，由于存活細(xì)胞數(shù)少，未測出。熊果苷顯示有抑制

6、黑素生成和抑制酪氨酸酶活性的作用，高濃度作用明顯，但無明顯濃度依賴性，與空白對(duì)照組比較，濃度為31.25、62.5、125、250和500μg/ml的熊果苷作用72小時(shí)后，B16細(xì)胞酪氨酸酶活性分別為90.19％、78.03％、56.45％、63.72％和43.70％，黑素含量分別為87.69％、89.08％、74.86％、62.07％和33.78％，結(jié)果與甘草黃酮相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。新型內(nèi)皮素拮抗劑單獨(dú)作用于B1

7、6細(xì)胞，對(duì)其黑素合成和酪氨酸酶活性無明顯作用。濃度為31.25、62.5、125、250和500μg/ml的內(nèi)皮素拮抗劑作用72小時(shí)后，B16細(xì)胞酪氨酸酶活性分別為103.04％、100.55％、103.75％、98.14％和96.30％，黑素含量分別為100.31％、98.33％、102.55％、99.97％和98.26％。實(shí)驗(yàn)第三部分的結(jié)果顯示：單獨(dú)加入內(nèi)皮素0.5μg/ml作用48h，與空白組相比，細(xì)胞增殖加快，數(shù)量明顯增多，酪氨

8、酸酶活性升高(p<0.01)，說明內(nèi)皮素有促進(jìn)B16細(xì)胞增殖，提高酪氨酸酶活性，增加黑素生成的作用。同時(shí)加入內(nèi)皮素拮抗劑200μg/ml，作用48h，細(xì)胞數(shù)量和酪氨酸酶活性未見明顯升高。與內(nèi)皮素組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，說明內(nèi)皮素拮抗劑具有拮抗內(nèi)皮素的作用。對(duì)照組熊果苷與內(nèi)皮素組相比，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。單獨(dú)加入內(nèi)皮素0.5μg/ml作用24h，細(xì)胞數(shù)量較空白組明顯增多，再加入拮抗劑200μg/ml作用24

9、h后，仍能顯示酪氨酸酶活性降低(p<0.05)，說明即使先加入內(nèi)皮素一段時(shí)間后再加拮抗劑，拮抗劑仍能對(duì)抗內(nèi)皮素對(duì)酪氨酸酶活性的激活作用，使細(xì)胞酪氨酸酶活性恢復(fù)至空白對(duì)照水平左右。 結(jié)論：熊果苷和甘草黃酮證實(shí)均有抑制黑素生成的作用，甘草黃酮對(duì)黑素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性呈濃度依賴性抑制，高濃度呈現(xiàn)細(xì)胞毒性。熊果苷對(duì)酪氨酸酶活性具有抑制作用，但沒有明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系。對(duì)內(nèi)皮素引起的酪氨酸酶活性升高，未見明顯拮抗作用。提示黑素合成的調(diào)節(jié)機(jī)