菜蛾盤絨繭蜂多分DNA病毒（CvBV）EP-1 like基因家族序列分析及EP-1 like 1基因表達研究.pdf

1、多分DNA病毒(polydnavirus，PDV)是一類與寄生蜂有專性互惠共生關系的特殊昆蟲病毒，其基因的表達對抑制寄主免疫反應、保證寄生蜂卵發(fā)育有重要作用。EP基因家族是繭蜂科昆蟲所擁有的PDV(繭蜂病毒Bracovirus，BV)的一個重要基因家族，具有重要的生理作用。本研究測定了菜蛾盤絨繭蜂病毒Cotesia vestalis bracovirus(CvBV)EP-1 like基因家族7個基因的cDNA全序列，并進行了序列分析。在

2、此基礎上，將EP-1 like 1(EPL-1)基因與原核表達載體pET-28a和pET-30a連接，從而構建、篩選了高效表達重組載體pET28-EPL-1，并在大腸桿菌中表達了EPL-1融合蛋白。采用傳統(tǒng)割膠回收的方法回收純化表達蛋白，并將純化后的蛋白免疫新西蘭大耳兔，制備了抗EPL-1多克隆抗體；以此多克隆抗體為基礎研究了EPL-1基因在被寄生后寄主小菜蛾Plutella xylostella幼蟲體內的蛋白含量變化；最后利用熒光定量

3、PCR分析了EPL-1基因在寄主小菜蛾體內的轉錄動態(tài)。 本研究的主要結果如下： (1)應用cDNA末端快速擴增技術(RACE)的方法獲得了EP-1 like基因家族7個基因的cDNA序列全長，相關推導蛋白氨基酸序列的翻譯后加工和信號肽的預測分別采用網(wǎng)上搜索工具EXPASY和SignalP軟件，發(fā)現(xiàn)CvBV編碼的EP-1 like蛋白中雖然不存在保守功能域但N端都具有一個信號肽編碼序列和眾多的理論蛋白質修飾和功能位點。在利

4、用BLASTP搜索獲得同源蛋白后構建了以氨基酸序列為基礎的進化樹，由此發(fā)現(xiàn)CvBV編碼的該基因家族成員之間關系并不密切，同時整個PDV編碼的該基因家族成員之間可以劃分成4個類群，其中EPL-1和EPL-2，EPL-3和EPL-4分別處于同一類群，但它們位于不同分支上。另外，EPL-5和CcBV early-expressed蛋白處于同一類群；EPL-7與部分GiBV和CcBV蛋白處于同一類群。 (2)將PCR擴增得到EPL-1基

5、因ORF(921bp)克隆到表達載體pET-28a和pET-30a中，構建并篩選了高效表達重組載體pET28-EPL-1，在IPTG進行誘導的情況下，正確表達了分子量為34.8kDa的重組融合蛋白。在大量表達EPL-1蛋白的基礎上，通過傳統(tǒng)割膠回收、電透析的方法純化表達蛋白并免疫新西蘭大耳兔，制備了抗EPL-1蛋白的多克隆抗體(效價1：128,000)，同時用Western Blot檢測了抗體的特異性。 (3)以制備的抗EPL-

6、1多克隆抗體為一抗，間接ELISA法檢測小菜蛾幼蟲體內EPL-1蛋白含量變化。結果表明在被寄生的小菜蛾幼蟲血漿和血細胞內EPL-1蛋白的含量都隨時間的延長而增加，在寄生后第6天達到峰值。 (4)利用熒光定量PCR分析了CvBVEPL-1基因在寄主小菜蛾體內的轉錄動態(tài)，發(fā)現(xiàn)在被寄生6天內的小菜蛾幼蟲體內都可以檢測到EPL-1基因的轉錄，但是在寄生后寄主體內EPL-1基因的轉錄出現(xiàn)了2次轉錄高峰(2 d p.p.和5 d p.p.)；具體至

7、寄生后寄主的腦、血淋巴和中腸時又發(fā)現(xiàn)其轉錄模式各不相同：在寄生后2h就能檢測到該基因在寄主腦組織內的轉錄，轉錄高峰出現(xiàn)在12 hp.p.，此后轉錄水平迅速降低；在寄生后6h就能檢測到該基因在寄主中腸中的轉錄，轉錄高峰出現(xiàn)在12 hp.p.，此后轉錄水平逐漸減低；在寄生后12h就能檢測到該基因在寄主血淋巴中的轉錄，同時轉錄水平在寄生后的6d內持續(xù)上升。所以EPL-1基因在小菜蛾幼蟲血淋巴內的轉錄水平是隨著寄生后時間的延長而提高，這與EPL