蒽醌類BH3模擬物Compound6誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的分子藥理學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、Bcl-2家族蛋白對(duì)于細(xì)胞凋亡的調(diào)控起著關(guān)鍵性作用。小分子Bcl-2類蛋白抑制劑是通過模擬促凋亡蛋白BH3-only蛋白，從而抑制抗凋亡蛋白的功能，為新的抗腫瘤治療策略提供了一個(gè)非常有前景的方向。
　　黑色素瘤中的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路是高度激活的，直接或間接導(dǎo)致了黑色素瘤對(duì)目前幾乎所有的治療手段的抗性和不良預(yù)后。Bcl-2類蛋白抑制劑在黑色素瘤的分子藥理研究中同樣發(fā)現(xiàn)了抗性問題，可能也和MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)

2、。因此，研究Bcl-2類蛋白抑制劑誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制不僅有助于更深入的了解黑色素瘤的藥物抗性的分子機(jī)制，同時(shí)也為未來發(fā)展黑色素瘤的治療策略和臨床研究提供了理論依據(jù)。
　　本文對(duì)比研究BH3模擬物S1、gossypol和ABT-737在黑色素瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒性，及這些BH3模擬物對(duì)Bcl-2家族蛋白之間相互作用的影響，揭示了高水平磷酸化的抗凋亡蛋白Mcl-1(pMcl-1)是黑色素瘤對(duì)目前已知BH3模擬物抗性的關(guān)鍵原因。

3、本課題組設(shè)計(jì)合成了一系列蒽醌類BH3模擬物小分子Bcl-2類蛋白抑制劑。與目前其他的BH3模擬物不同的是，它們實(shí)現(xiàn)了對(duì)重要BH3-only蛋白Bim螺旋的雙面模擬，達(dá)到從結(jié)構(gòu)和功能兩個(gè)方面模擬Bim蛋白α-螺旋，以高親和力結(jié)合Bcl-2家族中抗凋亡蛋白，并誘導(dǎo)Bax/Bak依賴的內(nèi)源細(xì)胞凋亡。本文篩選得到蒽醌類BH3模擬物Compound6。與上述其他BH3模擬物不同的是，Compound6能夠克服黑色素瘤抗性，顯著地誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋

4、亡。
　　通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Compound6對(duì)黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)Bcl-2家族蛋白之間相互作用的影響，并用免疫印跡法檢測(cè)了后續(xù)Bax/Bak的激活、細(xì)胞色素C釋放、PARP的剪切和caspase-3/9的激活。這些結(jié)果表明Compound6是通過解離細(xì)胞中pMcl-1/Bim和pMcl-1/Bak異源二聚體，誘導(dǎo)Bax/Bak依賴的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡來殺傷黑色素瘤細(xì)胞的。
　　本文還利用免疫印跡法分析了ERK抑制劑PD980

5、59和JNK抑制劑SP610025對(duì)黑色素瘤中Mcl-1磷酸化水平的影響，結(jié)果表明ERK與JNK都參與了黑色素瘤中Mcl-1蛋白的磷酸化。接下來，通過MTT法檢測(cè)了PD98059和SP610025聯(lián)合S1作用在黑色素瘤中的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明PD98059和SP610025都能顯著地增強(qiáng)黑色素瘤對(duì)S1的敏感性，這進(jìn)一步的證實(shí)了是ERK與JNK誘導(dǎo)的Mcl-1磷酸化導(dǎo)致了黑色素瘤對(duì)BH3模擬物的抗性。
　　免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在Com

6、pound6的作用下黑色素瘤中的pMcl-1會(huì)發(fā)生降解。接下來，本文利用蛋白酶體抑制劑MG-132和廣譜caspase抑制劑zVADfmk分別與Compound6聯(lián)合作用黑色素瘤細(xì)胞，結(jié)果表明Compound6能夠引起的pMcl-1降解是capase依賴的。
　　在本文的研究中還發(fā)現(xiàn)A375細(xì)胞在Compound6的作用下會(huì)發(fā)生Noxa表達(dá)水平的上調(diào)，經(jīng)過進(jìn)一步使用定量PCR的方法發(fā)現(xiàn)Noxa的上調(diào)是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。最后，利用No

7、xa的shNoxa下調(diào)黑色素瘤中的Noxa蛋白水平，并通過MTT法、免疫印跡法和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Compound6在其中的毒性，以及對(duì)pMcl-/Bim，pMcl-1/Bak復(fù)合物的影響，結(jié)果表明Compound6誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡并不依賴于Noxa水平的上調(diào)。
　　本研究首次證實(shí)了pMcl-1能夠拮抗的BH3模擬物小分子Bcl-2抑制劑，確定了ERK與JNK都參與了Mcl-1磷酸化并增強(qiáng)其抗凋亡功能，并確定pMcl-1是黑