去鐵胺和鐵調素對高鐵環(huán)境下斑馬魚骨形成指標影響的實驗研究.pdf

1、第一部分去鐵胺在鐵過載相關骨形成抑制中的治療作用
　　目的:近年來,鐵過載被認為是骨質疏松癥的獨立危險因素。鐵過載可以促進破骨細胞分化和骨的再吸收。本文研究了鐵過載對斑馬魚成骨細胞分化和骨形成的影響,并進一步探討去鐵胺(DFO)對鐵過載斑馬魚骨形成的治療作用,為鐵過載相關骨質疏松癥的治療提供理論依據。
　　方法:以受精后第2天(2 dpf)斑馬魚幼魚為模型,用不同濃度的枸櫞酸鐵胺FAC(10、25、50、100μg/mL)干

2、預斑馬魚,于6 dpf進行茜素紅染色并統(tǒng)計骨礦化面積;在上述100μg/mL FAC干預6 dpf基礎上,再移除FAC,用不同濃度的DFO(1、10、100μM)處理至10dpf。進行茜素紅染色,對斑馬魚進行椎體個數統(tǒng)計,并用實時定量PCR方法檢測了各組之間成骨細胞特異性基因(runx2a、runx2b、bglap、spp1、alpl和col1a1a)的表達差異;用ICP/MS分析了各組間的鐵元素含量;用DCFH-DA檢測了各組間斑馬魚

3、體內的活性氧(ROS)水平。
　　結果:(1)、用不同濃度 FAC處理斑馬魚后,斑馬魚骨礦化面積成劑量依賴性降低,與對照組相比,100μg/mL濃度組差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05);成骨細胞特異性基因表達下調;與對照組相比,100μg/mL FAC處理時斑馬魚體內鐵含量增加3.2倍(p<0.05);ROS水平增加4.2倍(p<0.05)。(2)、DFO可增加高鐵干預后斑馬魚的椎體個數,且呈劑量依賴性效應。成骨細胞特異性基因表達

4、較高鐵干預組有明顯提高。與高鐵干預相比,用10和100μM DFO處理使斑馬魚體內鐵含量降低23.3％和58.9％(p<0.05);ROS水平同樣降低了37.5％和50.9％(p<0.05)。
　　結論:鐵過載通過增加斑馬魚體內氧化應激水平抑制斑馬魚骨形成,去鐵胺(DFO)通過螯合鐵過載斑馬魚體內過多的鐵離子,降低鐵過載引起的氧化損傷,從而緩解鐵過載所致的骨形成抑制作用。
　　第二部分鐵調素在鐵過載所致的斑馬魚骨形成抑制中的

5、保護作用
　　目的:通過前期研究,我們已經證實鐵過載可以抑制斑馬魚骨形成,為觀察鐵調素在鐵過載抑制斑馬魚骨形成中的預防作用,我們構建了含有斑馬魚鐵調素的表達載體。以期為進一步研究“鐵調素預防圍絕經期和絕經后骨質疏松癥”提供實驗依據。
　　方法：以斑馬魚受精卵為模型,用不同濃度的枸櫞酸鐵胺FAC(10、25、50、100μg/mL)干預,第4天進行茜素紅染色并統(tǒng)計骨礦化面積,選擇FAC最適干預濃度;挑選發(fā)育至1-2細胞期的斑馬

6、魚受精卵,顯微注射入不同濃度的帶Flag標簽的鐵調素 mRNA(0、50、250、500ng/μL),用Western Blot檢測斑馬魚體內Hepcidin-Flag融合蛋白的表達情況。將注射了不同濃度鐵調素 mRNA的受精卵置于含100μg/mL FAC的培養(yǎng)液中,干預至第4天進行茜素紅染色,用實時定量PCR方法檢測骨鈣素(bglap)及runx2a、runx2b基因的表達變化情況;用ICP/MS分析了各組間的鐵元素含量;用DCFH

7、-DA檢測了各組間斑馬魚體內的活性氧(ROS)水平。
　　結果：(1)、成功構建了斑馬魚鐵調素表達載體,在斑馬魚受精卵內顯微注射體外轉錄的hepcidin-flag mRNA,能被有效翻譯成鐵調素蛋白。(2)、當鐵調素濃度為250ng/μL及500ng/μL時,能顯著預防鐵過載所導致的斑馬魚骨形成抑制作用(p<0.05),減緩FAC干預引起的斑馬魚成骨細胞bglap及runx2a、runx2b的表達下調(p<0.05);與FAC組