球化交聯(lián)酶聚集體的制備及催化性能研究.pdf

1、　　為避免固定化酶過(guò)程中載體的引入“稀釋”單位體積酶活性,并且實(shí)現(xiàn)形貌、大小可控的固定化酶粒子,將交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)技術(shù)與乳化技術(shù)相結(jié)合制備球化交聯(lián)酶聚集體(sphere-CLEAs),實(shí)現(xiàn)酶的無(wú)載體固定化的思路。以漆酶與脂肪酶作為模型酶,對(duì)sphere-CLEAs制備過(guò)程、形貌及催化特性等進(jìn)行了研究。
　　研究了漆酶交聯(lián)酶聚集體(CLEAs-La)的制備與催化性能。利用沉淀劑對(duì)酶溶液進(jìn)行沉淀,并利用戊二醛進(jìn)行交聯(lián),同時(shí)

2、利用天然蛋清作為蛋白添加劑,與漆酶共沉淀,制備 CLEAs-La-egg,提高CLEAs-La活性與穩(wěn)定性。通過(guò)優(yōu)化CLEAs-La沉淀與交聯(lián)過(guò)程,確定了CLEAs-La制備條件為25℃下,以飽和硫酸銨為沉淀劑,沉淀1 h后,加入0.09 mL,25%戊二醛交聯(lián)4 h,蛋清與漆酶質(zhì)量比為4.3：1,此時(shí)CLEAs-La-egg活性較CLEAs-La提高了約15.5%。通過(guò)SEM觀察CLEAs-La顆粒粒徑在200-800 nm之間,但形

3、貌不規(guī)則?？疾炝擞坞x漆酶、CLEAs-La和CLEAs-La-egg的催化特性,發(fā)現(xiàn)游離漆酶催化活性最低, CLEAs-La-egg 熱穩(wěn)定性、對(duì)變性劑鹽酸胍和尿素抗性與對(duì)蛋白酶水解抗性均高于CLEAs-La。在去除氯酚過(guò)程中,反應(yīng)30 h后,CLEAs-La-egg對(duì)4-氯酚與2,4-二氯酚的去除率分別為83.6%與91.5%,CLEAs-La相對(duì)應(yīng)去除率為75.8%與89.7%,游離酶僅為39.1%與76.3%。
　　在CL

4、EAs-La研究基礎(chǔ)上,為制備形貌規(guī)則,顆粒可控的固定化酶,利用乳化法在水/苯-甲苯體系中制備漆酶球化交聯(lián)酶聚集體(sphere-CLEAs-La)。利用純BSA制備球化粒子,通過(guò)SEM觀察發(fā)現(xiàn)體系蛋白含量對(duì)球化粒子形貌有顯著影響。通過(guò)乳化漆酶溶液與苯-甲苯兩相介質(zhì)來(lái)制備sphere-CLEAs-La,確定制備條件為BSA與粗漆酶質(zhì)量比為0.25,水相/有機(jī)相體積比為1：5,70μL 25%的戊二醛為交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)。并研究了其熱穩(wěn)定性、

5、對(duì)變性劑與胰蛋白酶抗性,相對(duì)游離酶其催化特性有了明顯提高,對(duì)4-氯酚與2,4-二氯酚去除率分別為84.87%與91.98%,與CLEAs-egg比較,去除率有所提高。
　　研究了脂肪酶球化交聯(lián)酶聚集體(sphere-CLEAs-Li)的制備。優(yōu)化得到了制備條件：脂肪酶與BSA質(zhì)量比為0.65,180μL 25%戊二醛為交聯(lián)劑,以200μL三丁酸甘油酯為保護(hù)劑。研究了球化脂肪酶在不同極性有機(jī)溶劑正己烷、丙酮和乙腈中的耐受性和熱穩(wěn)定

6、性,發(fā)現(xiàn)溶劑極性越大、溫度越高酶失活越嚴(yán)重,sphere-CLEAs-Li活性要高于游離脂肪酶,但加入保護(hù)劑的sphere-CLEAs-Li (sphere-CLEAs-Li/T)可保持最高酶活性。利用脂肪酶催化合成了乙酸甲酯,游離脂肪酶、sphere-CLEAs-Li 與sphere-CLEAs-Li/T催化轉(zhuǎn)化率分別為50%、68.75%和71%。進(jìn)一步研究了在催化酯化體系中重復(fù)利用性,11次后,sphere-CLEAs-Li催化酯