功能化氧化石墨烯細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究.pdf

1、開發(fā)高效低毒的基因轉(zhuǎn)染載體是基因治療領(lǐng)域中的關(guān)鍵技術(shù)問題。近年來，憑借其獨(dú)特的理化性質(zhì)，功能化石墨烯在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注，顯示出良好的應(yīng)用前景。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑相比，聚乙二醇與聚乙烯亞胺共同修飾的氧化石墨烯(nGO-PEG-PEI)對(duì)質(zhì)粒DNA和siRNA的轉(zhuǎn)染效率更加理想，然而在高濃度下仍表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性。因此，本課題將系統(tǒng)研究并揭示其細(xì)胞毒性機(jī)理，以便將其進(jìn)一步優(yōu)化，并為開發(fā)出理想的基因轉(zhuǎn)染載體

2、提供重要的理論依據(jù)。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、艑?duì)nGO-PEG-PEI的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10μg/mL左右的nGO-PEG-PEI處理可造成多種細(xì)胞活性降低。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)表明該材料的細(xì)胞毒性是通過細(xì)胞壞死途徑產(chǎn)生，而非細(xì)胞凋亡途徑。通過比較MTT實(shí)驗(yàn)與AnnexinⅤ-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種實(shí)驗(yàn)方法的結(jié)果存在一定差異，結(jié)合其實(shí)驗(yàn)原理，分析得出nGO-PEG-PE

3、I可能影響了細(xì)胞周期。后續(xù)一系列研究表明，nGO-PEG-PEI引起HeLa細(xì)胞的S期細(xì)胞阻滯現(xiàn)象，且絕大部分死亡細(xì)胞處于S期:這些細(xì)胞因?yàn)椴荒茼樌瓿捎蒘期向G2期的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致細(xì)胞壞死。將細(xì)胞同步化在G1期后再經(jīng)nGO-PEG-PEI處理，發(fā)現(xiàn)，nGO-PEG-PEI處理組的細(xì)胞整個(gè)細(xì)胞周期變長(zhǎng)，且進(jìn)入S期時(shí)有顯著的延遲。
　?、茖?duì)nGO-PEG-PEI引發(fā)S期細(xì)胞阻滯的分子機(jī)理進(jìn)行了深入研究。實(shí)驗(yàn)表明，nGO-PEG-PEI引

4、起了嚴(yán)重的DNA損傷，而且引發(fā)S期檢驗(yàn)點(diǎn)活化所必需的Cdc25A高度磷酸化。免疫印跡的結(jié)果表明，nGO-PEG-PEI處理后的細(xì)胞中，Cdc25A活化通路中的相關(guān)蛋白質(zhì)，包括ATM/ATR及其它們對(duì)應(yīng)的底物Chk2和Chk1，其磷酸化水平均顯著提高。此外，nGO-PEG-PEI引發(fā)的S期細(xì)胞阻滯及細(xì)胞形態(tài)的改變可被Cdc25A磷酸化抑制劑AZD7762所抑制。由以上結(jié)果分析可知，nGO-PEG-PEI進(jìn)入細(xì)胞后，通過某種未知途徑引起DN

5、A損傷，而DNA損傷通過ATM-Chk2及ATR-Chk1兩條信號(hào)通路激活Cdc25A，從而激活S期檢驗(yàn)點(diǎn)，最終引起S期細(xì)胞阻滯和細(xì)胞周期的延長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)，造成細(xì)胞壞死。
　　⑶揭示了nGO-PEG-PEI介導(dǎo)的真核細(xì)胞壞死的分子機(jī)制，為深入探索GO及其衍生物的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)，尤其是其對(duì)真核細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響方面，提供了重要的理論依據(jù)，同時(shí)也為GO及其衍生物的改性以成為高效無毒的基因轉(zhuǎn)染載體提供了重要信息，在納米材料的生物學(xué)效應(yīng)及生物