基于MEA的PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和海馬腦片在鹽酸利多卡因作用下電刺激響應(yīng)特性研究.pdf

1、人類至今對(duì)腦的奧秘知之甚少，揭示腦的工作原理是當(dāng)代自然科學(xué)最大的挑戰(zhàn)之一。神經(jīng)元是大腦的基本組成單位，神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的信息感知、處理、傳遞機(jī)制是大腦高級(jí)活動(dòng)的基礎(chǔ)。因此，對(duì)大腦功能機(jī)制研究的一個(gè)有效途徑在于對(duì)神經(jīng)元的信號(hào)傳遞特性和對(duì)外界刺激的響應(yīng)特性進(jìn)行研究。本課題組首次提出了采用電壓閾值測(cè)定法評(píng)價(jià)待測(cè)因素對(duì)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)電興奮性的影響，該方法具有快速、定量等優(yōu)點(diǎn)，并且課題組前期利用了該方法對(duì)溫度、酒精、乙酰膽堿等具有單向變化規(guī)律的外界因素進(jìn)行

2、研究。本論文選用具有雙相作用的鹽酸利多卡因作為研究對(duì)象，利用微電極陣列技術(shù)，通過對(duì)類神經(jīng)元細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)（PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)）和神經(jīng)組織（大鼠海馬腦片）在鹽酸利多卡因作用下電刺激響應(yīng)特性進(jìn)行了初步研究，定量地分析了不同濃度鹽酸利多卡因?qū)C12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和大鼠海馬腦片電興奮性的影響。另外本論文還進(jìn)行了PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)在不同濃度鹽酸利多卡因作用下高內(nèi)涵細(xì)胞組學(xué)實(shí)驗(yàn)，并與電壓閾值測(cè)定法實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。
　　本論文首先在MEA上培養(yǎng)PC12

3、細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成類神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，通過對(duì)不同濃度鹽酸利多卡因作用下PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的電刺激響應(yīng)信號(hào)探測(cè)實(shí)驗(yàn)，獲得了PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)在各個(gè)濃度鹽酸利多卡因作用下的電刺激電壓閾值。根據(jù)PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)刺激電刺激電壓閾值隨鹽酸利多卡因濃度的變化曲線，定量地分析了不同濃度鹽酸利多卡因?qū)C12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)電興奮性的影響。結(jié)果顯示: PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)在鹽酸利多卡因作用下電興奮性的變化具有濃度依賴性。當(dāng)鹽酸利多卡因濃度在0.1～1.2μg/mL之間可抑制PC1

4、2細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)電興奮性，即產(chǎn)生麻醉作用，其麻醉效果先隨濃度增加呈正相關(guān)性，在濃度為0.5μg/mL時(shí)達(dá)到最佳麻醉效果，然后隨濃度繼續(xù)增加而呈負(fù)相關(guān)性。而當(dāng)濃度超過1.2μg/mL后鹽酸利多卡因可增強(qiáng)PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)電興奮性，即產(chǎn)生興奮作用。且其興奮作用隨濃度增加而呈正相關(guān)性。但當(dāng)鹽酸利多卡因濃度超過1.5μg/mL后，PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)達(dá)到并維持在較高的興奮狀態(tài)，且僅需最小量(1mV)的電刺激即可持續(xù)爆發(fā)響應(yīng)信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相近。

5、r>　　然后本論文又制備了12～14天SD大鼠海馬腦片，進(jìn)行了0.1～5μg/mL范圍內(nèi)多個(gè)濃度鹽酸利多卡因作用下大鼠海馬腦片的電刺激響應(yīng)信號(hào)探測(cè)實(shí)驗(yàn)，獲得了大鼠海馬腦片在各個(gè)濃度鹽酸利多卡因作用下的電刺激電壓閾值。根據(jù)大鼠海馬腦片電刺激電壓閾值隨鹽酸利多卡因濃度的變化曲線，定量地分析了不同濃度鹽酸利多卡因?qū)Υ笫蠛ｑR腦片電興奮性的影響。實(shí)驗(yàn)獲得了與PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)部分、文獻(xiàn)報(bào)道相近的結(jié)果，即大鼠海馬腦片在鹽酸利多卡因作用下電興奮性的變化

6、具有濃度依賴性。當(dāng)鹽酸利多卡因濃度在0.1～1.2μg/mL之間可抑制大鼠海馬腦片電興奮性，即產(chǎn)生麻醉作用，且其麻醉效果先隨濃度增加呈正相關(guān)性，在0.6μg/mL時(shí)達(dá)到最佳效果，然后隨濃度繼續(xù)增加而呈負(fù)相關(guān)性。而當(dāng)濃度超過1.3μg/mL后鹽酸利多卡因可增強(qiáng)大鼠海馬腦片電興奮性，即產(chǎn)生興奮作用。且在1.3～1.5μg/mL范圍內(nèi)鹽酸利多卡因?qū)Υ笫蠛ｑR腦片的興奮作用隨濃度增加而呈正相關(guān)性。但當(dāng)鹽酸利多卡因濃度超過1.5μg/mL后，大鼠海

7、馬腦片達(dá)到并維持在較高的興奮狀態(tài)，且僅需最小量(1mV)的電刺激即可爆發(fā)響應(yīng)信號(hào)。
　　最后采用高內(nèi)涵細(xì)胞組學(xué)分析系統(tǒng)對(duì)不同濃度鹽酸利多卡因急性作用后的PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了熒光成像分析。首先采用PI染色方法對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，分析了0～1.7μg/mL濃度鹽酸利多卡因急性作用15分鐘后PC12細(xì)胞的凋亡程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鹽酸利多卡因急性作用后PC12細(xì)胞的PI染色呈陰性，PC12細(xì)胞無凋亡現(xiàn)象，表明此濃度范圍內(nèi)鹽酸利多卡因的急

8、性作用不會(huì)導(dǎo)致PC12細(xì)胞凋亡。隨后采用鬼筆環(huán)肽染色方法對(duì)PC12細(xì)胞的細(xì)胞骨架進(jìn)行標(biāo)記，分析了0～1.7μg/mL濃度鹽酸利多卡因急性作用15分鐘后PC12細(xì)胞的突起長度、面積的變化。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中每個(gè)細(xì)胞的平均突起長度、面積具有明顯差別。鹽酸利多卡因急性作用后PC12細(xì)胞的平均每個(gè)細(xì)胞突起長度、面積具有濃度依賴性，其變化規(guī)律與電刺激電壓閾值隨鹽酸利多卡因濃度變化的規(guī)律一致，從細(xì)胞組學(xué)角度（突起特性）驗(yàn)證了電壓閾值法的結(jié)果