伽瑪?shù)墩丈鋵?duì)匹羅卡品致癇大鼠DBP-ERK1-2信號(hào)通路的影響.pdf

1、[背景]癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì)目前世界上至少有5千萬癲癇患者,在我國(guó)的患病率約為4‰。顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy,TLE)由顳葉病灶所引起,是各種癲癇綜合征最常見的類型,嚴(yán)重影響患者正常的生活、工作和學(xué)習(xí),成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的一大頑癥。抗癲癇藥物通常是首選治療手段,然而在所有患者中大約有30％～50％屬于藥物難治性癲癇,需要考慮外科干預(yù)治療。而外科治療最關(guān)鍵的問題則是對(duì)致癇灶準(zhǔn)確定位,準(zhǔn)確地查出

2、致癇灶是外科治療成功的首要條件。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的迅猛發(fā)展,MRS、皮層腦電、深部腦電,PET、腦磁圖(MEG)的應(yīng)用,致癇灶定位的準(zhǔn)確性有了明顯的提高。在難治性癲癇的外科治療方面,源于外科手術(shù)治療的理論基礎(chǔ)及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),伽瑪?shù)稇?yīng)用已逐步擴(kuò)大,伽瑪?shù)斗派渫饪?Gamma knife radiosurgery,GKS)具有定位精確,高能量射線匯聚于靶點(diǎn),陡峭的輻射衰減梯度,對(duì)周圍組織損傷小的特點(diǎn)。利用不同直徑大小的準(zhǔn)直器,多個(gè)等中心照射,已成為

3、治療腦部腫瘤、血管畸形及癲癇等功能性疾病的一種重要方式。人們希望尋找一種低風(fēng)險(xiǎn)、低成本并且效果明顯的治療癲癇的方法。伽瑪?shù)对谥委燂D葉癲癇方面進(jìn)行了一些嘗試,它克服了既往開顱手術(shù)創(chuàng)傷大、受骨窗限制、并發(fā)癥高的缺點(diǎn),在治療癲癇方面顯示了微創(chuàng)不開顱、效果好、并發(fā)癥少的優(yōu)點(diǎn),還可以作為手術(shù)治療癲癇無效的一個(gè)補(bǔ)充治療措施,已越來越多地得到了臨床醫(yī)生的認(rèn)可。雖然近年來有關(guān)立體定向放射外科治療難治性癲癇的報(bào)道日漸增多,但有關(guān)癲癇發(fā)病機(jī)理及其放射外科治

4、療作用機(jī)制尚不明了。
　　 迄今人類對(duì)癲癇發(fā)病機(jī)制的研究仍主要靠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。目前癲癇動(dòng)物模型有一百多種之多,但完全符合人類顳葉癲癇發(fā)作特征及病理改變的模型較少,鋰一匹羅卡品顳葉癲癇模型就是其中的一種。隨著研究方向的深入及試驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步,對(duì)顳葉癲癇海馬的研究在病理變化、病理生理過程及分子學(xué)機(jī)制等方面均取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步,但依然有許多關(guān)鍵問題尚待解決。海馬是顳葉癲癇的解剖起源。海馬硬化(hippocampus Sclerosis,HS)

5、是顳葉癲癇最常見的病理變化,包括神經(jīng)細(xì)胞丟失、膠質(zhì)細(xì)胞增生、苔蘚纖維出芽及突觸重組。海馬神經(jīng)元突觸重組及齒狀回顆粒細(xì)胞軸突(苔蘚纖維)出芽形成異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是癲癇反復(fù)發(fā)作的主要環(huán)節(jié)。顳葉癲癇形成過程實(shí)際上是海馬可塑性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建的過程。前期研究表明,MFS和突觸重組在癲癇發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。
　　 白蛋白-D位點(diǎn)結(jié)合蛋白(albumin D-site-binding protein,DBP)在顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制中有重要的作用。白

6、蛋白-D位點(diǎn)結(jié)合蛋白是一種具有拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,形成二聚體后與啟動(dòng)子結(jié)合,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。白蛋白-D位點(diǎn)結(jié)合蛋白以含有堿性/亮氨酸拉鏈(PARb Zip)結(jié)構(gòu)為特征,是具有PARb Zip保守區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子,參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。過度表達(dá)的白蛋白.D位點(diǎn)結(jié)合蛋白可以誘導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)激活,磷酸化后維持其活性。白蛋白-D位點(diǎn)結(jié)合蛋白還可能通過細(xì)胞外信號(hào)

7、調(diào)節(jié)蛋白激酶途徑參與癲癇的發(fā)生。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)家族中的一員。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)神經(jīng)活動(dòng)高度敏感,可以通過調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)和蛋白合成等影響突觸重塑、苔蘚纖維重組等。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路可能在難治性癲癇發(fā)病機(jī)制中起一定作用。
　　 本研究用氯化鋰-匹羅卡品成功將 SD大鼠致癲癇后,以白蛋

8、白-D位點(diǎn)結(jié)合蛋白為切入點(diǎn),檢測(cè)伽瑪?shù)墩丈浜箫D葉癲癇大鼠海馬區(qū)白蛋白-D位點(diǎn)結(jié)合蛋白及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化后的表達(dá)情況,以進(jìn)一步了解DBP-ERK1/2信號(hào)通路在匹羅卡品點(diǎn)燃癲癇病理過程中的作用,并初步探討伽瑪?shù)墩丈淦チ_卡品致癇大鼠的作用機(jī)制,以期為臨床治療癲癇尋找到更好的作用靶點(diǎn)。
　　 [目的]
　　 1.制作匹羅卡品誘發(fā)SD大鼠癲癇模型,觀測(cè)與癲癇發(fā)生有關(guān)的信使指標(biāo),如DBP、p-ERK1/2表達(dá),探討癲癇

9、發(fā)生機(jī)理；
　　 2.采用伽瑪?shù)墩丈浒d癇模型鼠,研究伽瑪?shù)兜淖饔脵C(jī)制。
　　 [方法]
　　 1.SPF級(jí)健康成年SD大鼠110只,分為生理鹽水對(duì)照組(腹腔注射生理鹽水),非伽瑪?shù)墩丈渲掳B模型組(匹羅卡品致癇大鼠模型鼠不給予伽瑪?shù)墩丈?,伽瑪?shù)墩丈渲掳B模型組(匹羅卡品致癇大鼠模型鼠給予伽瑪?shù)墩丈?,各組又按照伽瑪?shù)墩丈浜筇幩罆r(shí)間3h,7d,15d,30d,60d,分為5個(gè)亞組,每亞組6只行白蛋白-D位點(diǎn)結(jié)合蛋白及

10、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶表達(dá)的檢測(cè),另生理鹽水對(duì)照組與非伽瑪?shù)墩丈渲掳B模型組每亞組2只行尼氏染色。
　　 2.鋰-匹羅卡品癲癇模型建立。實(shí)驗(yàn)組大鼠依次給予氯化鋰、硫酸阿托品、匹羅卡品腹腔注射誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE),持續(xù)1h后注射地西泮終止發(fā)作。其后每天觀察其自發(fā)性癇性發(fā)作(spontaneous recurrentseizures,SRS)。生理鹽水對(duì)照組在與氯化鋰-匹羅卡品實(shí)驗(yàn)組大鼠

11、相同的時(shí)間點(diǎn),給予大鼠腹腔注射生理鹽水125mg/kg,注射后也立即開始觀察大鼠的行為學(xué)變化。
　　 3.設(shè)計(jì)制作大鼠伽瑪?shù)抖ㄎ活^架。動(dòng)物固定架選用無磁性高強(qiáng)度的有機(jī)玻璃板、布膠板、硬橡膠棒等作為材料,主體為一塊有機(jī)玻璃固定板,板上面頭端裝有固定動(dòng)物頭部的裝置,采用3點(diǎn)定位固定,由兩側(cè)的耳塞及前端固定牙齒的裝置組成,均可隨意調(diào)節(jié)。固定板下面巧妙地設(shè)計(jì)了4個(gè)支柱,可牢靠固定在Leksell框架后面兩個(gè)豎柱上。
　　 4.伽

12、瑪?shù)墩丈?。伽瑪?shù)墩丈渲掳B模型組在10％水合氯醛麻醉下,被固定于伽瑪?shù)秾Ｓ么笫蠊潭苌?用磁共振成像(MRI)進(jìn)行腦冠狀面的連續(xù)掃描,計(jì)算確定照射靶區(qū)為左側(cè)海馬的X.Y.Z的座標(biāo)。然后將大鼠固定架連接于4mm準(zhǔn)直器上,調(diào)整好座標(biāo),用伽瑪?shù)秾?shí)施照射,周邊劑量12Gy,等劑量曲線為50％,中心劑量為24Gy。
　　 5.生理鹽水對(duì)照組和非伽瑪?shù)墩丈渲掳B模型組海馬組織病理檢測(cè)。分別于上述5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)分批處死大鼠取左側(cè)海馬組織標(biāo)本,行冠

13、狀冰凍切片,切取8um薄片和25um厚片,直接貼在多聚賴氨酸包被的載玻片上,行Nissl染色。鏡下觀察海馬區(qū)域的病理改變。
　　 6.Western blotting法檢測(cè)DBP蛋白、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)情況。各組于上述5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)分批處死大鼠取左側(cè)海馬組織標(biāo)本,常規(guī)按Santa Cruz試劑盒總蛋白提取方法提取組織總蛋白、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交與顯色。ECL發(fā)光法顯示特異條帶,可達(dá)膠片暗盒曝光、顯影、定影,將條帶用計(jì)算機(jī)

14、成像系統(tǒng)采集,用Image Tool5.0測(cè)定分析條帶灰度值,并與內(nèi)參灰度值相比,得到相對(duì)比值作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平,取重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 7.所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±s)表示,所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的計(jì)量資料采用完全隨機(jī)分組兩因素析因設(shè)計(jì)資料的方差分析,方差齊時(shí)采用LSD法進(jìn)行組間多重比較,方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法進(jìn)行組間多重比較；本研

15、究中規(guī)定顯著性水平α=0.05,P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1.行為學(xué)觀察。行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)可見致癇大鼠出現(xiàn)Ⅰ-Ⅳ級(jí)的反復(fù)自發(fā)性癇性發(fā)作,有時(shí)甚至可見到Ⅴ級(jí)的SRS。一般持續(xù)30s左右,均可自行終止。本研究的后期,伽瑪?shù)墩丈渲掳B模型組大鼠較非伽瑪?shù)墩丈渲掳B模型組大鼠自發(fā)性癇性發(fā)作次數(shù)減少。
　　 2.Nissl染色顯示。非伽瑪?shù)墩丈渲掳B模型組大鼠左側(cè)齒狀回、門區(qū)、CA1區(qū)、CA3區(qū)可

16、見胞漿尼氏小體減少、細(xì)胞輪廓模糊、排列紊亂、神經(jīng)元數(shù)量減少,齒狀回顆粒細(xì)胞層邊界不整齊、增寬、排列松散、紊亂,以上變化隨著時(shí)間的延長(zhǎng)更加明顯。
　　 3.匹羅卡品點(diǎn)燃模型后大鼠海馬區(qū)的白蛋白-D位點(diǎn)結(jié)合蛋白被激活,并隨時(shí)間出現(xiàn)有規(guī)律的變化,在各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠海馬區(qū)白蛋白-D位點(diǎn)結(jié)合蛋白的表達(dá)與生理鹽水對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而伽瑪?shù)墩丈淠芤种七@種激活(P<0.05)。海馬區(qū)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化后的變化