PCR檢測大鼠卡氏肺孢子菌感染的研究.pdf

1、目的：肺孢子菌是一種機(jī)會致病性真菌，某些艾滋病、器官移植、惡性腫瘤等免疫功能低下的患者易被感染，嚴(yán)重者不及時(shí)治療可導(dǎo)致死亡。因此，早期準(zhǔn)確、及時(shí)的診斷肺孢子菌感染在臨床治療方面是十分關(guān)鍵的。目前診斷肺孢子菌感染最常用的方法是病原學(xué)檢測，染色鏡檢的優(yōu)點(diǎn)是可直接觀察到病原體，特異性較好，但缺點(diǎn)是操作繁瑣、敏感性較低，許多學(xué)者將研究方向轉(zhuǎn)向免疫學(xué)和分子學(xué)診斷，來提高肺孢子菌感染的檢出率。本研究應(yīng)用地塞米松連續(xù)肌肉注射誘導(dǎo)Wistar大鼠感染肺

2、孢子菌，建立肺孢子菌肺炎(PCP)動(dòng)物模型，設(shè)計(jì)引物，建立PCR方法。采集PCP模型動(dòng)物血液、肺、腎、肝、脾等組織及肺泡灌洗液分別進(jìn)行PCR檢測，并與Giemsa染色病原檢測結(jié)果在特異性和敏感性方面進(jìn)行比較，以期建立一種敏感性和特異性都較好的檢測大鼠卡氏肺孢子菌的PCR方法，為臨床檢測人感染耶氏肺孢子菌提供檢測手段。
　　 方法：雌性Wistar大鼠50只，6周齡，體重180-210g。按文獻(xiàn)報(bào)告方法建立大鼠肺孢子菌肺炎(PCP

3、)模型。將50只Wistar大鼠隨機(jī)分成3組：空白對照組10只，實(shí)驗(yàn)對照組10只，實(shí)驗(yàn)組30只.分籠飼養(yǎng)，每籠5只，常規(guī)飼養(yǎng)1周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠腹股溝皮下注射地塞米松1mg/只/次，每周2次，連續(xù)12周，期間給予常規(guī)商品飼料，為防細(xì)菌感染，在大鼠飲水中加入四環(huán)素，濃度為1g/L；同時(shí)實(shí)驗(yàn)對照組大鼠腹股溝皮下注射等量的生理鹽水，并給予常規(guī)飼料和飲水；空白對照組10只大鼠給予常規(guī)飼料和飲水，鼠籠及墊料定期更換、消毒。
　　 于飼養(yǎng)第二

4、周后將實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對照組和空白對照組大鼠分別取血，EDTA抗凝，離心，上清凍存(-80℃)，沉淀用蒸餾水洗2次，生理鹽水洗1次，棄上清，凍存。然后以同樣方法分別于第五周、第六周、第七周、第八周、第九周、第12周取血凍存。飼養(yǎng)12周后，乙醚麻醉大鼠，抽取肺泡灌洗液，并取肺組織、肝組織、腎組織、脾組織進(jìn)行卡氏肺孢子菌的PCR檢測，同時(shí)做各組織的印片，進(jìn)行Giemsa染色，同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成兩對引物：第一對引物為根據(jù)5SrRNA基因設(shè)計(jì)的引

5、物Ⅰ：5’－AGTTACGGCCATACCTCAGA－3’，引物Ⅱ：5’－AAAGCTACAGCACGTCGTAT-3’；第二對引物為根據(jù)線粒體rRNA大亞基基因(MT基因)設(shè)計(jì)引物Ⅰ：5’－GATGGCTGTTTCCAAGCCCA－3’，引物Ⅱ：5’－GTGTACGTTGCAAAGTACTC-3’。利用兩對引物分別作PCR檢測，將PCR檢測結(jié)果與病原學(xué)檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、一般狀況
　　

6、 實(shí)驗(yàn)對照組和空白對照組大鼠一般狀況良好，飲食及活動(dòng)正常，毛色有光澤，均能健康存活，第12周處死時(shí)，肺臟未見病變。
　　 實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)后，從第三周開始部分大鼠活動(dòng)及攝食明顯減少，消瘦，體毛灰暗無光澤，精神萎靡，常成群擠在一個(gè)角落，并出現(xiàn)呼吸急促等癥狀，解剖可見肺臟萎縮，表面可見結(jié)節(jié)樣米粒大小的病灶散在分布，部分融合成片狀。
　　 2、病原學(xué)檢查(Giemsa染色)
　　 肺組織印片病原學(xué)檢查結(jié)果：空

7、白對照組10只大鼠及實(shí)驗(yàn)對照組10只大鼠肺組織印片中均未查到卡氏肺孢子菌包囊，實(shí)驗(yàn)組25只大鼠肺組織印片中有18只查到卡氏肺孢子菌包囊，陽性率為72％(18/25)。
　　 肝、腎、脾組織印片病原學(xué)檢查結(jié)果：空白對照組10只大鼠、實(shí)驗(yàn)對照組10只大鼠及實(shí)驗(yàn)組25只大鼠肝、腎、脾組織印片中均未查到卡氏肺孢子菌包囊。
　　 支氣管肺泡灌洗液涂片病原學(xué)檢查結(jié)果：空白對照組10只大鼠及實(shí)驗(yàn)對照組10只大鼠支氣管肺泡灌洗液涂片中均

8、未查到卡氏肺孢子菌包囊，實(shí)驗(yàn)組25只大鼠支氣管肺泡灌洗液涂片中有15只查到卡氏肺孢子菌包囊，陽性率為60％(15/25)。
　　 3、PCR檢測結(jié)果
　　 肺組織DNA的PCR檢測結(jié)果：空白對照組10只大鼠及實(shí)驗(yàn)對照組10只大鼠肺組織DNA均未擴(kuò)增出特異條帶，為陰性，25只實(shí)驗(yàn)組大鼠有22只擴(kuò)增出特異條帶，為陽性，陽性率為88％(22/25)。第一對引物與第二對引物的擴(kuò)增電泳結(jié)果一致。
　　 支氣管肺泡灌洗液(B

9、ALF)PCR檢測結(jié)果：空白對照組10只大鼠及實(shí)驗(yàn)對照組10只大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)均未擴(kuò)增出特異條帶，為陰性；25只實(shí)驗(yàn)組大鼠支氣管肺泡灌洗液利用第一對引物擴(kuò)增有17只擴(kuò)增出特異條帶，為陽性，陽性率為68％(17/25)，利用第二對引物擴(kuò)增有18只擴(kuò)增出特異條帶，為陽性，陽性率為72％(18/25)。
　　 肝、腎、脾組織DNA的PCR檢測結(jié)果：空白對照組10只大鼠、實(shí)驗(yàn)對照組10只大鼠及實(shí)驗(yàn)組25只大鼠肝、腎、脾組

10、織DNA利用第一對引物及第二對引物均未擴(kuò)增出特異條帶，為陰性。
　　 白細(xì)胞DNA的PCR檢測結(jié)果：空白對照組10只大鼠、實(shí)驗(yàn)對照組10只大鼠及實(shí)驗(yàn)組25只大鼠白細(xì)胞DNA利用第一對引物及第二對引物均未擴(kuò)增出特異條帶，為陰性。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)成功建立了卡氏肺孢子菌動(dòng)物模型，合成了兩對引物(第一對引物為根據(jù)5SrRNA基因設(shè)計(jì)的引物Ⅰ：5’－AGTTACGGCCATACCTCAGA－3’，引物Ⅱ：5

11、’－AAAGCTACAGCACGTCGTAT-3’；第二對引物為根據(jù)線粒體rRNA大亞基基因(MT基因)設(shè)計(jì)的引物Ⅰ：5’－GATGGCTGTTTCCAAGCCCA-3’，引物Ⅱ：5’－GTGTACGTTGCAAAGTACTC-3’并成功建立了卡氏肺孢子菌的PCR檢測方法。
　　 2.將PCR方法和病原學(xué)方法進(jìn)行了比較，PCR檢測大鼠肺組織及氣管肺泡灌洗液中卡氏肺孢子菌的陽性率分別為88％和68％，病原學(xué)方法檢測的陽性率分別為7