擬諾卡氏放線菌抗腫瘤活性物分離純化及其活性研究.pdf

1、放線菌是一類主要呈菌絲狀生長和以孢子繁殖的陸生性較強(qiáng)原核生物，在生長繁殖過程中能夠產(chǎn)生大量的抗生素、酶及抑制劑等具有生物活性的物質(zhì)，因而是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生物學(xué)功能的微生物資源。從全國各地采集的土樣中篩選出49株放線菌，經(jīng)抗腫瘤活性檢測(cè)，從中篩選出一株具有廣譜高效抗腫瘤活性的放線菌。結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化特征和16S rRNA基因序列同源性比對(duì)分析，確定該菌株為擬諾卡氏放線菌，命名為Nocardiopsis.spX032，簡稱NX

2、032（保藏號(hào)為CCTCC NO:M2015361），并通過多步分離純化分別得到具有抗腫瘤活性的小分子和蛋白質(zhì)。
　　NX032發(fā)酵培養(yǎng)12天，發(fā)酵上清液通過DM-301大孔樹脂吸附，經(jīng)高效液相色譜(Agilent1290 Infinity)分析，獲得具有抗腫瘤活性的小分子物質(zhì)Peak1;同時(shí)發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨沉淀，蛋白粗提物利用sephadexG75葡聚糖凝膠柱分離，收集峰A進(jìn)行活性檢測(cè)和SDS-PAGE分析，得到具有抗腫瘤活性

3、的單一蛋白條帶。LC-MS/MS鑒定表明Peak1分子量大小為158.03 KDa，峰A蛋白為ATP synthase subunit a，其大小30.2 KDa。
　　Peak1(NZF1)和活性物質(zhì)峰A(NZP1)分別作用于小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16)、人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人肝癌細(xì)胞(Hep-3B)和人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。MTT數(shù)據(jù)顯示，三種腫瘤細(xì)胞增殖受到明顯抑制，且具有濃度依賴性，對(duì)正常細(xì)胞HUVEC增殖影

4、響相對(duì)腫瘤細(xì)胞較小。DNA Ladder實(shí)驗(yàn)中，NZF1和NZP1處理B16細(xì)胞，DNA在瓊脂糖凝膠檢測(cè)時(shí)均出現(xiàn)了“梯狀”條帶。經(jīng)Hochest33342、tubulin Alexa Fluor488和MitoTrackerRed CMVRos分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡（Confocal）觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示:腫瘤細(xì)胞整體皺縮變小變圓，細(xì)胞核形狀變得不規(guī)則，染色質(zhì)出現(xiàn)凝聚，微管蛋白熒光分布極不均勻，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，處

5、理組HUVEC細(xì)胞與陰性對(duì)照相比變化不大。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期阻滯和凋亡與壞死結(jié)果顯示:NZF1處理后將細(xì)胞阻滯在G2期，NZP1處理后將細(xì)胞阻滯在S期且二者處理后凋亡區(qū)域細(xì)胞數(shù)均明顯上升。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NZF1和NZP1處理后促凋亡相關(guān)因子PARP, Bax表達(dá)上調(diào)，而抑制凋亡相關(guān)因子Bcl-2表達(dá)下調(diào)。上述結(jié)果表明，NZF1和NZP1可能是通過線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且對(duì)正常細(xì)胞影響較小。這為擬諾卡氏放