AT2R基因轉(zhuǎn)染表達(dá)對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、研究背景：
　　 冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)作為心血管病中發(fā)病率與死亡率均較高的心血管病之一，嚴(yán)重危害人們身體健康，而且這些年來(lái)其發(fā)病率在我國(guó)有顯著增加的趨勢(shì)，成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。冠心病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程受諸多因素影響，其中由于動(dòng)脈粥樣硬化 (Atherosclerosis As) 斑塊形成造成的動(dòng)脈血管壁增厚、硬化、鈣化、斑塊破裂、血栓形成，最終

2、導(dǎo)致管腔狹窄甚至閉塞，是以冠心病為代表的動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。以經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention PCI)為代表的心血管介入技術(shù)給冠心病的臨床治療帶來(lái)了革命性的變化，挽救了無(wú)數(shù)人的生命，成為心血管臨床領(lǐng)域最有效的方法之一，但PCI 術(shù)后再狹窄由于其發(fā)病率高，處理困難，因而嚴(yán)重影響了PCI的遠(yuǎn)期療效，盡管隨著介入技術(shù)的發(fā)展及新型藥物洗脫支架的應(yīng)用，PCI 再狹窄率已有顯著降低

3、，但仍有3-10％的發(fā)生率。因此，如何防止再狹窄成為冠心病治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。
　　 Schwartz等研究表明，再狹窄的病理基礎(chǔ)是新生內(nèi)膜增生，而新生內(nèi)膜形成過(guò)程中，由于血管損傷，血管結(jié)構(gòu)破壞，使血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth musclecell,VSMCs)由中膜層向內(nèi)膜層遷移，并在包括血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)在內(nèi)的多種因子作用下，發(fā)生表型變化，由收縮型轉(zhuǎn)為分泌型，并分泌大量細(xì)

4、胞因子、炎癥因子，反過(guò)來(lái)又加速了VSMCs在局部的增殖以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成，從而最終導(dǎo)致支架內(nèi)再狹窄。
　　 因此，遷移增殖的VSMCs的平滑肌細(xì)胞是增厚的新生內(nèi)膜的主要組織學(xué)成分。
　　 而抑制VSMCs的遷移增殖也就成為防治再狹窄的一個(gè)重要靶點(diǎn)。
　　 AngⅡ是一多向作用因子，它與不同的受體亞型結(jié)合產(chǎn)生不同的生物學(xué)作用，血管緊張素Ⅱ1型受體(angⅡ type 1receptor，AT1R)介

5、導(dǎo)產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)血管收縮等作用, 血管緊張素Ⅱ2 型受體(angⅡ type 2 receptor，AT2R)卻與之相拮抗。由于AT2R在成年動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)較少或不表達(dá)，因此，在新生內(nèi)膜形成過(guò)程中，AngⅡ主要通過(guò)AT1R作用導(dǎo)致和加速新生內(nèi)膜的形成。如果某種方法能夠增強(qiáng)AT2R的表達(dá)，則可通過(guò)其與AT1R 相拮抗的作用來(lái)抵消AT1R的生物學(xué)效應(yīng)，從而達(dá)到抑制血管新生內(nèi)膜形成的目的。這是本課題立題的理論基礎(chǔ)。

6、　　 研究目的：
　　 1.以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)作為基因轉(zhuǎn)染示蹤物，構(gòu)建EGFP-AT2R 融合蛋白的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠VSMCs。
　　 2.檢測(cè)AT2R基因在大鼠VSMCs中的mRNA及蛋白表達(dá)水平,證實(shí)可通過(guò)真核表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染VSMCs 并獲得較好表達(dá)率。
　　 3.檢測(cè)AT2R 高表達(dá)對(duì)VSMCs的增殖與凋

7、亡的影響,證實(shí)AT2R在VSMCs的表達(dá)可明顯抑制其增殖并促進(jìn)其凋亡，從而為AT2R基因治療血管再狹窄(restenosis, RS)的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 1．用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VSMC；倒置顯微鏡行形態(tài)學(xué)觀察并使用免疫熒光法檢測(cè)α-SM-actin 鑒定VSMCs。
　　 2.以pUHD-10.3/AT2R 質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增AT2R基因的全長(zhǎng)cDNA 序列, 再

8、將其克隆入載體pEGFP-N2，構(gòu)建其真核表達(dá)載體pEGFP-N2/AT2R。
　　 3.脂質(zhì)體Lipofectamine2000對(duì)VSMCs 進(jìn)行AT2R 轉(zhuǎn)染；倒置熒光顯微鏡觀測(cè)轉(zhuǎn)染后VSMCs 生長(zhǎng)變化，用RT-PCR及Western blot 檢測(cè)AT2R在其中的表達(dá)情況。
　　 4．通過(guò)MTT 試驗(yàn)，檢測(cè)AT2R基因?qū)Υ笫骎SMCs 增殖能力影響, Western blot檢測(cè)AT2R對(duì)VSMC的增殖細(xì)胞抗原(

9、PCNA)的影響。
　　 5．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AT2R基因?qū)Υ笫骎SMCs 促凋亡作用。
　　 研究結(jié)果：
　　 1．本實(shí)驗(yàn)利用組織塊貼壁法成功地培養(yǎng)了大鼠VSMCs，并由形態(tài)學(xué)及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)證實(shí)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供了平臺(tái)；
　　 2．pEGFP-N2/AT2R 成功構(gòu)建，經(jīng)測(cè)序與NCBI基因庫(kù)報(bào)道序列完全一致。
　　 3.AT2R 轉(zhuǎn)染VSMCs后，熒光顯微鏡下檢測(cè)其陽(yáng)性表達(dá)率大約在40％，經(jīng)R

10、T-PCR及Western blot 證實(shí)重組真核表達(dá)載體pEGFP-N2/AT2R 轉(zhuǎn)染組的AT2R基因mRNA及蛋白表達(dá)水平高于未轉(zhuǎn)染組及pEGFP-N2 轉(zhuǎn)染組。
　　 4．轉(zhuǎn)染AT2R基因組MTT 吸光度值（0.141±0.015），明顯低于未轉(zhuǎn)染組（0. 315±
　　 0.031）和pEGFP-N2 轉(zhuǎn)染組（0.295±0.023），而未轉(zhuǎn)染組和pEGFP-N2 轉(zhuǎn)染組之間無(wú)差異；Western Blot 發(fā)

11、現(xiàn)pEGFP-N2/AT2R 轉(zhuǎn)染組PCNA蛋白的表達(dá)顯著低于pEGFP-N2轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組，表明AT2R 高表達(dá)后能夠下調(diào)PCNA蛋白表達(dá)，與MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果一致。
　　 5.流式細(xì)胞術(shù)表明與未轉(zhuǎn)染組和pEGFP-N2 轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染AT2R基因可以促進(jìn)VSMCs 早期凋亡。
　　 研究結(jié)論：
　　 1．真核表達(dá)載體pEGFP-N2/AT2R 成功構(gòu)建,并在VSMCs中穩(wěn)定表達(dá).
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