美洲大蠊多肽提取物制備工藝及抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的：
　　初步優(yōu)選美洲大蠊多肽提取物的提取方法、多肽含量測定方法，深入研究美洲大蠊多肽提取物的體內(nèi)抗腫瘤作用及體外對腫瘤細胞增殖及凋亡的影響，旨在為美洲大蠊用于惡性腫瘤的治療提供科學的實驗依據(jù)，同時可為從天然藥物中提取低毒高效的抗腫瘤活性部位提供新方向。
　　方法：
　?。?）制備工藝研究：采用超聲法、滲濾法、加熱回流法三種方法提取美洲大蠊多肽，同時采用福林酚法和雙縮脲法兩種方法測定美洲大蠊多肽提取物中的多肽含量，比

2、較三種提取方法和兩種測定方法的結果從而初步優(yōu)選美洲大蠊多肽提取物的提取方法及多肽測定方法。
　　（2）體內(nèi)抗腫瘤活性評價：建立小鼠肝癌H22和小鼠肉瘤S180的移植性腫瘤模型，檢測美洲大蠊多肽提取物對腫瘤生長的影響。觀察小鼠的活動情況及體重變化，評價美洲大蠊多肽提取物的體內(nèi)抗腫瘤活性。
　　（3）體外對腫瘤細胞增殖及凋亡的影響：以A549（人肺腺癌細胞株）、SGC-7901（人胃癌細胞株）和Hela（人宮頸癌細胞株）為實驗對

3、象，經(jīng)不同濃度的美洲大蠊多肽提取物作用48 h后，采用Cell Counting Kit(CCK-8)WST-8試劑盒測定對腫瘤細胞增殖的抑制作用。美洲大蠊多肽提取物對A549細胞凋亡的影響采用Hoechst33258熒光染色及流式細胞儀AnnexinV/PI雙染法進行檢測。
　　結果：
　?。?）加熱回流法提取的美洲大蠊多肽含量為34.18％和30.05%，超聲法為25.63%和20.19%，滲濾法為28.74%和24.9

4、0%，加熱回流法對美洲大蠊多肽的提取明顯優(yōu)于超聲法和滲濾法。雙縮脲法測定美洲大蠊多肽提取物中的多肽含量為25.63%、28.74%、34.18%，福林酚法為20.19%、24.90%、30.05%，通過兩種方法的比較，雙縮脲法對多肽測定存在高效性，明顯優(yōu)于福林酚法。
　?。?）美洲大蠊多肽提取物25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg（以多肽濃度計算）對H22實體瘤生長的抑瘤率分別為23.77%、35.83%、65.63%

5、；對S180實體瘤生長的抑瘤率分別為20.16%、35.27%、57.36%，明顯抑制S180和H22荷瘤小鼠腫瘤的生長。
　?。?）美洲大蠊多肽提取物能明顯抑制A549細胞的增殖，隨濃度的增加，抑制作用增強，其IC50為54.65±1.73μg/ml，但對SCG-7901、Hela細胞作用不強，因此僅采用A549細胞進行后續(xù)研究。美洲大蠊多肽提取物作用于A549細胞48h后，Hoechst33258熒光染色顯示,不同濃度的美洲大

6、蠊多肽提取物干預后可見核濃縮致密的強熒光團塊及核碎裂等細胞凋亡形態(tài)學改變，且呈現(xiàn)出一定的量效關系，而陰性對照組成彌散均勻的淡藍色弱熒光。AnnexinV/PI雙染法檢測顯示,10、20、40、80、160μg/ml（以多肽濃度計算）的美洲大蠊多肽提取物均可誘導A549細胞凋亡，凋亡率分別為20.43±1.53%,34.86±2.01%,44.68±1.84%,53.19±1.53和65.57±2.14%,與陰性對照組比較，差異有顯著性（