miR-101和miR-125a-5P在LPS誘導THP-1巨噬細胞自噬過程中的作用.pdf

1、【研究背景】膿毒癥（ sepsis）是一種感染所致的全身炎癥反應綜合征（SIRS），由于容易合并多器官衰竭（MOF），病死率高，是重癥監(jiān)護病房（ICU）非心血管疾病的主要死亡原因之一。膿毒癥的病理生理機制異常復雜，主要涉及炎癥的激活、內皮細胞損傷、微循環(huán)障礙、凝血功能障礙、免疫抑制、細胞凋亡、基因多態(tài)性、神經-內分泌-免疫調控紊亂等一系列問題，但具體機制仍不明確。新近的研究表明，細胞自噬（autophagy）也參與了膿毒癥的發(fā)病，細胞自

2、噬在膿毒癥中被激活，通過維持細胞內平衡、限制細胞損傷和死亡而起保護作用。然而，當細胞自噬過度激活時，不一定對病原體感染的細胞起保護作用，既往細胞實驗已證實，自噬機制會為入侵的細菌最初的存活和繁殖提供條件。但是細胞自噬在膿毒癥中所起的作用仍不明確，有待進一步探索。微小核糖核酸（miRNAs）也參與了免疫細胞功能和細胞自噬的調控。有研究表明選用脂多糖（LPS）在體外刺激巨噬細胞，巨噬細胞的應答是通過調控miRNAs中的let-7e、miR-

3、181c、miR-155和miR-125b的表達而完成的。研究表明體外培養(yǎng)的肺泡巨噬細胞株受LPS刺激后，miR-146a在巨噬細胞株中表達增高。前期研究也證實，miR-129和miR-142-3p參與調控THP-1細胞的炎癥/自噬水平。通過生物信息學軟件比對，篩選出miR-101和miR-125a-5p，這兩個miRNAs可能靶向作用于自噬相關基因4D（ATG4D），而后者是自噬過程中的一個重要分子。因此，通過體外培養(yǎng)THP-1細胞，

4、經PMA誘導分化為THP-1巨噬細胞后，用LPS刺激THP-1巨噬細胞建立細胞模型，采用轉染的方法在細胞內過表達miR-101和miR-125a-5p，檢測相應的自噬相關蛋白表達變化，探討這兩個miRNAs對LPS誘導的細胞自噬的調控作用。
　　【研究目的】證明miR-101、miR-125a-5p對LPS誘導的免疫細胞自噬過程中的調控作用。
　　【研究方法】
　　1. THP-1細胞的復蘇、培養(yǎng)、傳代、凍存，以及TH

5、P-1巨噬細胞的誘導。
　　2.采用不同濃度（0ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml）LPS處理THP-1巨噬細胞12小時后，利用MTS細胞增殖實驗檢測細胞活力水平，利用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、MCP-1水平，利用蛋白免疫印記技術（ Western blot）檢測自噬相關蛋白( LC3II、Beclin1、ATG4D)的表達變化。
　　3.采用LPS500ng

6、/ml處理THP-1巨噬細胞12小時后，通過定量PCR檢測miR-101、miR-125a-5p表達的情況。
　　4.轉染試劑脂質體 lipofectamine RNAiMAX介導 miRNA模擬物（miRNA-mimic）轉染THP-1巨噬細胞，轉染4小時后，通過熒光顯微鏡檢測miRNA-mimic的轉染效率。
　　5.轉染THP-1巨噬細胞24小時后，LPS500ng/ml處理THP-1巨噬細胞12小時后，利用蛋白免疫印

7、記技術（Western blot）檢測自噬相關蛋白( LC3II、Beclin1、ATG4D)的表達變化情況。
　　【結果】
　　1. LPS刺激THP-1巨噬細胞后炎癥因子的釋放情況：LPS刺激THP-1巨噬細胞12小時后TNF-α、MCP-1釋放水平較空白對照組均顯著上升。
　　2. LPS刺激THP-1巨噬細胞后自噬相關蛋白的變化：LPS刺激THP-1巨噬細胞12小時后，LC3II、Beclin1、ATG4D表達

8、均上調，細胞自噬增強，LPS濃度為500 ng/ml時，效果最明顯。
　　3. LPS刺激THP-1巨噬細胞后相關miRNAs變化情況：LPS刺激THP-1巨噬細胞12小時后，miR-101、miR-125a-5p較空白對照組表達均顯著下降。
　　4.過表達miR-101、miR-125a-5p對LC3II、Beclin1、ATG4D蛋白水平的影響：在細胞內分別過表達miR-101、miR-125a-5p后，LC3II、AT