梓醇對H-,2-O-,2-誘導HUVECs和H9c2細胞凋亡的影響及其機制的研究.pdf

1、凋亡在眾多的病理生理過程中起著重要的作用。細胞生長和凋亡之間的平衡決定著許多病理生理過程,如高血壓,動脈粥樣硬化,血管疾病的發(fā)生發(fā)展。在動脈粥樣硬化形成過程中過多的活性氧的產(chǎn)生加速了動脈粥樣硬化,最終導致了心血管疾病的發(fā)生。
　　 H202是體內(nèi)氧化代謝的產(chǎn)物,也是一種活性氧,它不僅能直接氧化細胞膜上的脂質(zhì)及蛋白,而且能自由穿過細胞膜,導致脂質(zhì)過氧化反應和細胞內(nèi)DNA的損傷。H2O2還可以通過降低細胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)誘導細胞凋亡。

2、進一步的研究表明H2O2刺激線粒體釋放細胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C),引起細胞結(jié)構(gòu),功能,代謝的改變,進而引起血管疾病的發(fā)生。
　　 梓醇(catalpol)是一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷類化合物,在神經(jīng)細胞及其他細胞系的研究中發(fā)現(xiàn)它具有抗凋亡的作用。體外實驗發(fā)現(xiàn)梓醇能抑制H2O2誘導PCl2細胞凋亡,激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路促進分化。梓醇對心血管氧化應激的作用還未有報道,但有研究表明梓醇能抑制腦缺血再灌注動物模型中的

3、氧化應激,在外周組織如腎臟中,梓醇也具有保護作用。因此,我們很有理由去研究梓醇是否也能對抗心血管疾病中的氧化應激損傷。
　　 Akt信號途徑是細胞重要的促增殖、遷移及存活信號途徑。多種生長因子均可通過PI3K途徑激活Akt/PKB。完全活化的Akt通過磷酸化和鈍化其下游底物,經(jīng)由多種途徑而促進細胞的存活。例如胞質(zhì)內(nèi)Bad能被Akt磷酸化,磷酸化后的Bad不能轉(zhuǎn)位進入線粒體,抑制Cyt-C釋放入胞質(zhì),減少caspase-3活化,進

4、而抑制細胞凋亡。根據(jù)功能可將Bcl-2基因家族分為兩類:一類是抗凋亡的,如Bcl-2、Bcl-XL；一類是促凋亡的,如Bax、Bad等。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),位于線粒體外膜的Bcl-2家族蛋白,能通過改變線粒體細胞膜的通透性,誘導細胞凋亡。
　　 本實驗觀察了在離體細胞給予梓醇治療是否可以減輕H2O2損傷導致內(nèi)皮及心肌細胞凋亡以及分析了梓醇抗血管內(nèi)皮及心肌細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導機制,尤其是梓醇的這種保護作用是否是部分通過激活傳導通路P

5、I3K/Akt,調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達而實現(xiàn)的。
　　 材料與方法：
　　 (1)人臍靜脈內(nèi)皮細胞,H9c2細胞培養(yǎng),梓醇和/或H2O2共同孵育,收集細胞及細胞培養(yǎng)液；分別加入PI3K的特異性抑制劑wortmannin及LY294002進行干預,收集細胞及細胞培養(yǎng)液,用于指標檢測。
　　 (2)采用MTT法檢測梓醇對HUVECs及H9c2細胞存活率的影響。
　　 (3)應用LDH,SOD,MDA檢測

6、試劑盒檢測細胞LDH,SOD,MDA的活性。
　　 (4)采用激光共聚焦法檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)的濃度。
　　 (5)應用Annexin V-FITC、TUNEL和hoechst 33258試劑盒檢測細胞的凋亡。
　　 (6)采用western blotting法檢測HUVECs及H9c2細胞Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2和Bax蛋白的表達。
　　 (7)采用real time RT-PC

7、R法檢測內(nèi)皮細胞Akt、Bad、Bcl-2及Bax mRNA的表達。
　　 (8)采用免疫組化法檢測心肌細胞p-Akt、Bcl-2和Bax蛋白的表達。
　　 (9)各實驗組數(shù)據(jù)均用(x)±s表示,利用spss11.5統(tǒng)計軟件分析,組間差異比較采用單因素方差分析。P<0.05為有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)果：
　　 (1)Catalpol終濃度為0.1～10μg/ml時可促進細胞存活,呈劑量依賴性。但catal

8、pol終濃度高至1000μg/ml時則出現(xiàn)增殖抑制效應。
　　 (2)10μg/ml catalpol處理0h、24h、48h、72h,較對照組細胞存活率明顯升高。Catalpol作用72h時,HUVECs存活率達峰值；梓醇作用48h時,H9c2存活率達峰值。
　　 (3)不同濃度0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml catalpol預處理可以減輕H2O2誘導的細胞損傷,隨著catalpol濃度的增加,相應的M

9、TT檢測的OD值也隨之增加。
　　 (4)H2O2組在H2O2作用后內(nèi)皮及心肌細胞受到損傷,LDH較C組明顯增高,損傷后MDA亦較C組明顯增高,SOD較C組明顯降低(均P<0.05)。Catalpol(0.1～10μg/ml)預處理培養(yǎng)細胞,在H2O2損傷過程中,均較H2O2組細胞損傷小,LDH和MDA含量明顯減少,而SOD則較H2O2組明顯增加。
　　 (5)經(jīng)H2O2處理24h后,細胞內(nèi)熒光強度明顯增強,用不同的濃度

10、catalpol(0.1～10μg/ml)預處理24h后,與H2O2組相比細胞內(nèi)熒光強度明顯下降為,呈濃度依賴性。
　　 (6)內(nèi)皮細胞C組可見少許的TUNEL陽性細胞。與C組相比,細胞在H2O2(100μmol/L)中培養(yǎng)24h明顯增加TUNEL,陽性細胞數(shù),然而,當用catalpol(0.1～10μg/ml)預處理24h后加入H2o2(100μmol/L)作用24h,凋亡率明顯下降,且隨著catalpol劑量增加凋亡率降低。

11、
　　 (7)正常的心肌細胞核呈圓形或橢圓形,染色均勻,呈正常的藍色,而凋亡細胞的細胞核有明顯的染色質(zhì)邊聚呈致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染,變形亮度增強,顏色發(fā)白。Hoechst 33258結(jié)果顯示:C組細胞少見白色亮點,H2O2組細胞見大量凋亡細胞。經(jīng)不同濃度catalpol處理后,白色亮點呈逐漸減少趨勢,凋亡細胞明顯減低,呈劑量相關(guān)性。
　　 (8)Annexin-FITC/PI檢測內(nèi)皮細胞凋亡率顯示C組細胞的存活率為

12、78.7±1.2％；而H2O2(100μmol/L)組細胞的凋亡率顯著升高,凋亡率為35.9±0.6％,說明H2O2誘導了內(nèi)皮細胞的凋亡。用不同濃度的catalpol(0.1、1、10μg/ml)預處理各組細胞后再施以H2O2作用,細胞的凋亡率出現(xiàn)不同程度的下降,而且隨著catalpol濃度的升高,各組細胞的凋亡率也隨之依次下降,細胞凋亡率分別降低至27.6±0.6％,22.6±0.8％和19.1±0.4％。
　　 H2O2組心

13、肌細胞凋亡率明顯高于C組(P<0.01)；與H2O2組比較,catalpoll、catalpol2、catalpol3組細胞凋亡率明顯降低(P<0.01),且隨著catalpol劑量增加凋亡率降低。
　　 (9)Western blotting結(jié)果顯示:H2O2作用24h后,Akt在各組中都有表達,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),p-Akt,p-Bad,Bcl-2蛋白表達量較C組明顯減少,Bax蛋白表達較C組明顯增加,差異具有

14、顯著性(P<0.01)。Catalpol 0.1,0,10μg/ml可以劑量依賴性地增加p-Akt,p-Bad,Bcl-2蛋白表達,降低Bax蛋白的表達,與H2O2組比較差均有顯著性(P<0.05,P<0.01)。Wortmannin和LY294002預處理可拮抗catalpol部分保護作用。
　　 免疫組化結(jié)果顯示,在光鏡下,心肌細胞陽性表達的p-Akt,Bcl-2,Bax蛋白主要積聚在胞漿中,呈棕色反應,各組蛋白表達強度不一

15、致。積分光密度值檢測結(jié)果顯示,與C組比較,H2O2組細胞p-Akt,Bcl-2蛋白表達減弱(P<0.05,P<0.01),Bax蛋白表達顯著增強(P<0.01)；與H2O2組比較,catalpolt、catalpol2、catalpol3組細胞的p-Akt,Bcl-2蛋白表達增高(P<0.01),Bax蛋白表達顯著減弱(P<0.01)。Wortmannin和LY294002可拮抗catalpol部分保護作用。
　　 (10)Re

16、al time RT-PCR結(jié)果顯示:H2O2作用24h后,Akt,Bad,Bcl-2 mRNA表達量較C組明顯減少,Bax mRNA表達較C組明顯增加。Catalpol 0.1,1,10μg/ml可以劑量依賴性地增加Akt,Bad,Bcl-2 mRNA表達,降低Bax mRNA的表達,與H202組比較差均有顯著性(P<0.05,P<0.01)。Wortmannin和LY294002預處理可拮抗catalpol部分保護作用。
　　

17、 結(jié)論：
　　 (1)Catalpol對HUVECs、H9c2細胞存活率的影響具有時間和劑量依賴性。
　　 (2)Catalpol通過降低MDA,增加SOD減輕H2O2誘導的細胞損傷。
　　 (3)Catalpol可能通過清除細胞內(nèi)過多的ROS來參與H2O2誘導細胞損傷的保護。
　　 (4)PI3K/Akt-Bad途徑可能為catalpol抗H2O2誘導細胞凋亡的重要信號轉(zhuǎn)導機制。
　　 (5)