鄰苯二甲酸酯降解菌的篩選、降解特性及其在土壤修復(fù)中的應(yīng)用研究.pdf

1、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中塑料薄膜、農(nóng)藥和化肥大規(guī)模地使用，以及污水灌溉和污泥的施用，使得農(nóng)田土壤中鄰苯二甲酸酯（PAEs）的污染嚴重。PAEs對農(nóng)田土壤的污染不僅會破壞土壤的質(zhì)量和生產(chǎn)功能，還能夠進入食物鏈進行富集，威脅人體健康。因此，如何消除農(nóng)田PAEs污染已經(jīng)成為亟待解決的問題。微生物降解被認為是自然環(huán)境中PAEs降解的主要途徑。大量的PAEs降解菌已從不同環(huán)境中被分離出來，但從糞肥中分離尚鮮見報道。有研究表明向土壤中施加糞肥有利于土壤中PAEs

2、的降解，但糞肥降解PAEs的作用機制并不明確。本研究以糞肥為起始接種物，分離獲得PAEs高效降解菌，并進行菌種鑒定；測定其降解特性，優(yōu)化降解條件；鑒定其降解產(chǎn)物，克隆獲得PAEs關(guān)鍵降解酶基因，綜合分析其降解途徑；利用降解菌對PAEs污染的土壤中進行修復(fù)實驗，揭示糞肥與PAEs降解菌在修復(fù)過程中的互作機制，為PAEs污染土壤的生物修復(fù)提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）降解菌株的篩選與鑒定。以4種PAEs為受試污染物，使用

3、濃度梯度馴化的方法，從糞肥中分離篩選獲得一株鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）降解菌。根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性以及16S rDNA序列同源性鑒定，確定該菌株為普羅維登氏菌（Providencia sp.2D）。
　　（2）菌株降解特性研究及降解條件優(yōu)化。通過單因素試驗，研究溫度、pH和接菌量對Providencia sp.2D降解性能的影響；再通過Central Composite Rotatable Design響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)

4、計，最終確定Providencia sp.2D最佳的降解條件為：溫度32.4℃，pH8.3，接菌量0.6（OD600）。在最佳降解條件下，Providencia sp.2D的降解動力學(xué)實驗結(jié)果表明：培養(yǎng)72h后，菌株2D對不同初始濃度DBP（50～1000mg/L）的降解率均達到80％以上，且降解過程符合一級動力學(xué)模型，降解半衰期處于8～27h之間。
　?。?）降解產(chǎn)物的鑒定、降解酶的克隆及降解途徑分析。通過GC-MS技術(shù)對DBP

5、及降解中間產(chǎn)物分析，克隆與驗證了Providencia sp.2D其降解關(guān)鍵酶基因，并進行了相關(guān)厭氧條件下的降解試驗，最終推測其降解途徑。
　　第一步：在Providencia sp.2D的作用下，DBP通過一次或二次酯鍵斷裂直接或間接生成鄰苯二甲酸（PA）；
　　第二步：Providencia sp.2D對PA的降解。好氧或厭氧條件下，Providencia sp.2D對PA可能表現(xiàn)出不同的降解途徑：好氧條件下，Provi

6、dencia sp.2D可編碼生成鄰苯二甲酸4，5-雙加氧酶，PA在其催化作用下被轉(zhuǎn)化為4，5-二羥基鄰苯二甲酸，4，5-二羥基鄰苯二甲酸再經(jīng)過脫羧反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為 PCA，之后在Providencia sp.2D編碼生成的原兒茶酸4，5-雙加氧酶的催化作用下，PCA被轉(zhuǎn)化為小分子有機酸，最終被礦化為CO2和H2O；在氧氣濃度較低的情況下，兼性厭氧性的Providencia sp.2D更傾向于通過脫羧反應(yīng)將PA轉(zhuǎn)化為苯甲酸（BA）；

7、　　第三步：Providencia sp.2D對BA的降解。BA可在無氧條件下被Providencia sp.2D徹底礦化為CO2和H2O；好氧條件下BA可被轉(zhuǎn)化為原二茶酸（PCA）或鄰苯二酚，之后被進一步礦化為CO2和H2O。
　?。?）Providencia sp.2D對DBP污染土壤和施加糞肥的DBP污染土壤的降解動力學(xué)研究。結(jié)果表明，Providencia sp.2D可高效降解土壤中DBP，且降解過程中可與土壤中的土著微生