簡介：廣州醫(yī)學院碩士學位論文從化市小兒呼吸道人類偏肺病毒感染的臨床與分子流行病學特征姓名陳能申請學位級別碩士專業(yè)指導教師周曉光20100501從化市小兒呼吸道人類偏肺病毒感染的臨床與分子流行病學特征3材料與方法（1）材料與方法（1）標本收集收集2008年12月至2009年10月從化中心醫(yī)院6歲以下呼吸道感染住院患兒氣道分泌物標本260例。（2）采用巢式聚合酶鏈式反應(yīng)（NESTEDPCR）檢測呼吸道分泌物HMPV感染，兩輪PCR擴增產(chǎn)物（HMPV1HMPV2）經(jīng)2瓊脂糖凝膠電泳后成像并存檔。（3）采用多重PCR（MULTIPLEPCR）檢測呼吸道合胞病毒A、B型（RSVARSVB），流感病毒甲、乙型（FLUAFLUB），副流感病毒1、2、3型（PIV1PIV2PIV3），PCR產(chǎn)物經(jīng)2瓊脂糖凝膠電泳后成像并存檔。（4）隨機挑選7例HMPV1陽性PCR產(chǎn)物進行基因測序，測序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司（INVITROGEN）完成。（5）所有測序結(jié)果與GENBANK中的序列進行比對，分析同源性；多重序列比對采用CLUSTALW軟件；種系進化分析采用DNASTAR軟件。結(jié)果（1）結(jié)果（1）HMPV1陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)2瓊脂糖凝膠電泳后成像并存檔，陽性標本和陽性對照于450BP～600BP間各出現(xiàn)一條目的條帶，與預(yù)期條帶大小一致（462BP）；HMPV2陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)2瓊脂糖凝膠電泳后成像，陽性標本和陽性對照于400BP～500BP間各出現(xiàn)一條目的條帶，與預(yù)期條帶大小一致（431BP）。（2）HMPV1男性陽性標本17例，陽性率983；女性標本4例，陽性率460。男、女感染陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義（Χ22132，P＞005）；HMPV2男性陽性標本36例，陽性率2081；女性標本12例，陽性率1379。男、女感染陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義（Χ22132，P＞005）。HMPV2男、女感染陽性率與HMPV1比較差異有統(tǒng)計學意義（Χ804P＜005Χ2441P＜005）。HMPV1發(fā)病年齡中年齡＜6個月組陽性率751；6個月＜年齡≦1歲組陽性率1311，兩個年齡組比較差異無統(tǒng)計學意義；HMPV2年齡＜6個月組陽性率1387；6個月＜年齡≦1歲組陽性率3115；1歲＜年齡≦3歲組陽性率2083。三個年齡組陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義。HMPV2發(fā)病年齡中1歲＜年齡≦3歲組陽性率與HMPV1比較有顯著性差異（Χ576P＜005）。HMPV感染3、4月份發(fā)病率較高，春季高發(fā)，發(fā)病高峰期與RSV感染有重疊。（3）HMPV1陽性標本21例，陽性率為808；HMPV2陽性標本48例，陽性率為1846。兩輪擴增產(chǎn)物陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義（Χ5414P＜005）。HMPV感染臨床表現(xiàn)以咳嗽和喘息為主；HMPV1感染患兒喘息癥狀及中性粒細胞百分比與PIV3感染比較差異有統(tǒng)計學意義（Χ24219，P＜005；T2424，P＜005）。HMPV2中性粒細胞百分比（N）與PIV3比較差異有統(tǒng)計學意義（T226P＜005）。

簡介：戊型肝炎HEPATITISE，HE是由戊型肝炎病毒HEPATITISEVIRUS，HEV感染引起的一種人畜共患病，主要暴發(fā)和流行于亞洲和非洲一些衛(wèi)生條件相對較差的發(fā)展中國家。人對HEV普遍易感，易感人群以大齡兒童和青壯年為主。在孕婦中可導致流產(chǎn)或引起死亡，病死率高達到15％～30％。2002～2004年衛(wèi)生部傳染病疫情報告顯示我國是戊型肝炎高發(fā)的國家，呈現(xiàn)持續(xù)增長的態(tài)勢，HE已經(jīng)成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。越來越多的研究證據(jù)表明HEV可感染豬、犬、牛、山羊、綿羊、鹿、靈長類、雞、貝類、嚙齒類等多種動物，在這些動物宿主中感染率最高是豬，而且從豬中分離到的病毒基因序列和人源毒株有較高的同源性。加之HEV與其它嗜肝性病毒相似，易降解、不穩(wěn)定，很難從糞便、膽汁等中分離到較大量的純HEV，缺乏合適的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，在很大程度上限制了HEV深入的研究。為了解昆明地區(qū)戊型肝炎流行情況和探索建立豬HEV感染動物模型，我們開展了昆明地區(qū)人、豬、犬HE的血清流行病學調(diào)查，并以長爪沙鼠和樹鼩建立豬HEV感染模型。本研究為進一步研究豬HEV的感染機制、研制有效的防控手段奠定了基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下1昆明地區(qū)戊型肝炎血清流行病學調(diào)查研究。為了解昆明地區(qū)人、豬、犬戊型肝炎的血清流行病學特征，應(yīng)用雙夾心抗原ELISA對采集自昆明地區(qū)人血清樣品456份、豬血清樣品835份、犬血清樣品285份進行HEVIGG抗體檢測。結(jié)果表明昆明地區(qū)人、豬、犬血清樣品中HEVIGG抗體陽性分別為4320％、5545％、2035％。人群中男性和女性HEVIGG抗體陽性率分別為4325％和4311％，男性和女性二者之間無顯著差異P＞00521～30歲4882％、31～40歲5086％、41～50歲4286％人群的HEV抗體陽性率顯著高于10～20歲2308％、51歲以上3289％人群P＜005。豬群中仔豬（1月齡～2月齡）、育肥豬（2月齡～6月齡）、種豬（6月齡以上）HEVIGG抗體陽性率分別為4685％、5706％、6542％。不同年齡組豬群抗HEVIGG陽性率存在差異且差異顯著P＜005。犬群中城市流浪犬、家庭散養(yǎng)犬和養(yǎng)殖場犬HEVIGG抗體陽性率分別為5918％、1316％和1071％，家庭散養(yǎng)犬、養(yǎng)殖場犬HEV與流浪犬HEVIGG抗體陽性率差異顯著P＜005。德國牧羊犬、昆明犬與雪橇犬、其他品種之間及雪橇犬與其他品種之間HEVIGG抗體陽性率顯著差異P＜005。1歲以下與1～5歲、5～10歲、10歲以上犬HEVIGG抗體陽性率顯著差異P＜005。研究表明昆明地區(qū)人、豬、犬中存在戊型肝炎的流行，人群、豬群和犬HEVIGG陽性率與年齡有關(guān)，21～50歲人群HEVIGG抗體陽性率相對10～20歲、51歲以上較高豬群HEVIGG陽性率隨年齡的增長而逐步升高犬HEVIGG抗體陽性率隨年齡的增長而逐步下降。2昆明及周邊縣豬戊型肝炎病毒分子流行病學調(diào)查研究。為了解昆明地區(qū)規(guī)?；i場中仔豬HEV的分子背景和流行特征，針對GENBANK中HEV的F2保守區(qū)域序列，設(shè)計合成兩對巢式PCR引物。分別對采集自昆明及周邊縣的187份仔豬糞便樣品進行擴增，PCR擴增出348BP左右的片段為陽性，陽性率為695％。祿勸縣、江川縣、富民縣陽性率分別為454％、800％、952％。對擴增片段進行核苷酸同源性比較和遺傳進化分析，9株豬HEV348BP擴增片段的核苷酸同源性為871％～994％，與HEVⅠ、Ⅱ、Ⅲ型同源性分別為770％～819％、522％～536％、770％～882％，與HEVⅣ型的同源性為779％～968％。通過遺傳進化樹分析得出所檢測到的9株豬HEV毒株均為HEV基因Ⅳ型。研究表明昆明地區(qū)規(guī)?；i場中仔豬群中存在HEV感染并且都為基因Ⅳ型。3戊型肝炎病毒感染豬肝臟的組織病理學觀察。為了解豬戊型肝炎病毒感染肝的組織病理學變化，應(yīng)用免疫組織化學染色和蘇木素伊紅染色對采集自昆明地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場上的待售豬肝樣品176份進行了組織病理學觀察。免疫組織化學染色觀察得出，市售豬肝呈HEV抗原陽性率為6534％。蘇木素伊紅染色觀察得出，5130％的豬肝組織出現(xiàn)炎性細胞浸潤，2870％的豬肝組織出現(xiàn)纖維結(jié)締組織增生，2087％的豬肝出現(xiàn)肝細胞萎縮，1913％的豬肝出現(xiàn)肝細胞變性、壞死。研究表明昆明地區(qū)市售豬肝中普遍存在HEV感染并出現(xiàn)相應(yīng)的病理學變化。4豬戊型肝炎病毒感染長爪沙鼠的實驗研究。為了探討建立豬戊型肝炎病毒感染長爪沙鼠模型的可能性，應(yīng)用HEV陽性豬糞便上清液腹腔注射接種長爪沙鼠，定期檢測長爪沙鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST水平的變化及肝臟、糞便、血液、小腸中HEVRNA的產(chǎn)生，病理組織學變化及HEV在肝臟中的分布情況。結(jié)果表明長爪沙鼠接種豬HEV后7天血清中ALT和AST均同步上升，此后開始降低。但ALT值到接種后35天還是沒有降低到對照組水平，攻毒組比陰性對照組數(shù)值高出2倍左右。AST到接種后35天基本回落到正常范圍內(nèi)（根據(jù)陰性對照）。糞便和肝臟中均能檢測到HEVRNA，血液和小腸偶能檢測HEVRNA。肝臟組織觀察到肝小葉間淋巴細胞浸潤、肝細胞顆粒變性，局灶性淋巴細胞浸潤、肝細胞索排列紊亂、膽管增生等。后期表現(xiàn)為多發(fā)性淋巴細胞浸潤、肝細胞壞死，枯否細胞增多，匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生。小腸、腎、腦、脾臟等組織也有不同程度病理變化。免疫組化檢測結(jié)果可見到肝細胞漿中有強陽性信號。說明成功建立了豬戊型肝炎病毒感染長爪沙鼠模型。5豬戊型肝炎病毒感染樹鼩的實驗研究。為了探討建立豬戊型肝炎病毒感染樹鼩模型的可能性，應(yīng)用HEVRNA陽性豬糞便上清液腹腔注射接種樹鼩，定期檢測樹鼩血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST水平的變化及肝臟、糞便、血液、小腸、腎臟、脾臟中HEVRNA的產(chǎn)生，病理組織學變化。結(jié)果表明樹鼩接種豬HEV后7天血清中ALT和AST均同步升高，此后開始降低。但ALT和AST到接種第28天還是沒有降低到對照組水平，攻毒組比陰性對照組數(shù)值高。樹鼩接種豬HEV7天后肝臟、糞便、血液、小腸中能檢測到HEVRNA，腎臟和脾臟中偶能檢測HEVRNA。肝臟可觀察到靜脈竇淤血、肝細胞空泡變性、多發(fā)性淋巴細胞浸潤、枯否細胞增多、匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生等病變。小腸、腎等組織也有不同程度病理變化。說明建立豬戊型肝炎病毒感染樹鼩模型是可行的，可為進一步研究HEV跨物種傳播和致病機制等奠定基礎(chǔ)。

簡介：目的本研究通過對2009～2014年福建省甲型H1N1流感（甲流）病毒的分子流行病學特征進行分析，結(jié)合本省流感的監(jiān)測情況，旨在探索該病毒在我省的基因變異和分子特征，掌握流感流行的趨勢，為預(yù)測疫苗的防治效果及防控甲流疫情提供科學依據(jù)。方法收集106株源自福建省各哨點醫(yī)院流感樣病例的甲流病毒毒株，通過RTPCR和測序方法獲得HA和NA基因的全長序列。運用分子生物學軟件和統(tǒng)計學軟件對序列進行拼接、比對和分析，以甲流病毒疫苗株ACALIFNIA072009H1N1為參考毒株，從多個方面對我省甲流的分子流行病學進行研究，結(jié)合流感監(jiān)測數(shù)據(jù)來揭示甲流在我省的流行規(guī)律和變異特征。結(jié)果1、2009～2014年福建省甲流經(jīng)歷了流行消長的反復(fù)過程，近兩年的流行強度更是加大，2014年下半年處于流行低谷，但很有可能迎來新的流行高峰。2、同源進化分析顯示，福建省甲流病毒HA基因與疫苗株的核苷酸和氨基酸的同源性分別在976％～996和972～991之間；NA基因則分別在987～996和974～996之間。隨著時間的推移，HA基因和NA基因的進化樹均逐漸形成6個分支，HA蛋白上的S143G、H138R、V249L、V234I、K163Q、S185T、S451N和NA蛋白上的K432E、V241I發(fā)生突變可能是導致毒株聚集成不同分枝的重要原因，其中H138R和S143G分別位于抗原決定簇CA上和其周圍，K163Q和S185T則分別位于抗原決定簇SA和SB上。3、抗原性分析顯示，2009～2014年期間福建省甲流病毒HA蛋白中共有97個氨基酸位點發(fā)生變化，其中有17個氨基酸位點，變異累計涉及4個抗原決定簇，也有部分毒株在190螺旋和220環(huán)上位點發(fā)生變異，從2012年開始，毒株相對疫苗株出現(xiàn)了較大的變異，氨基酸位點的變異個數(shù)均超過10個。福建省近年來的甲流毒株已經(jīng)出現(xiàn)了抗原漂移現(xiàn)象。抗原漂移株與非抗原漂移株在NA基因第34、44、200、241、321、369、386和432位點上的變異存在統(tǒng)計學差異。4、在本次甲流毒株中發(fā)現(xiàn)了D222G和Q293H位點的突變，但并未增強病毒毒力，所有毒株均表現(xiàn)為低致病性。5、本次研究中發(fā)現(xiàn)了“達菲”耐藥位點H275Y，并伴有可能會增強H275Y突變株NA酶活性及蛋白表達的V241I和N369K的同時突變。6、有3個毒株的HA蛋白上均增加一個位于抗原決定簇SA內(nèi)的糖基化位點NKS162164或NQS162164，其中2個毒株源于暴發(fā)疫情。在毒株中發(fā)現(xiàn)可能與耐藥相關(guān)的NA上的糖基化位點NQS4244的增加，在毒株AFUJIANFUZHOUSWL117242009H1N1上也發(fā)現(xiàn)了可能會影響病毒的組織嗜性尤其是神經(jīng)嗜性的NA蛋白的NGT146148位點的缺失。結(jié)論福建省甲流病毒已悄然發(fā)生遺傳變異和分子進化，與疫苗的同源性隨著時間的推移逐漸降低，并出現(xiàn)了51株抗原漂移株，且在NA基因上發(fā)現(xiàn)8個可能與抗原漂移現(xiàn)象相關(guān)的位點和H275Y耐藥位點。未來福建省可能會迎來新一輪甲流的流行。

簡介：人腺病毒HUMANADENOVIRUS，HADV是一類無包膜的雙鏈DNA病毒，分為A～G7個血清學組，包括56個血清型。HADV經(jīng)呼吸道和消化道傳播，可引起人多種器官感染，對小兒和免疫缺陷者危害尤為嚴重。HADV感染人體可引發(fā)急性腺病毒型肺炎、急性胃腸炎、眼角膜炎、乳糜瀉和急性間質(zhì)性腎炎等多種疾病。其中HADVB組感染目前已成為急性呼吸系統(tǒng)疾病ACUTERESPIRATYDISEASE，ARD的重要因素。超過5％的急性呼吸道傳染病為HADV感染所致，特別是在急性下呼吸道感染兒童患者中HADV感染陽性率最高可達373％。近年來，B2亞組中出現(xiàn)的新型HADVB55在成人特別是學校和軍隊特殊人群中引起日益頻繁的急性呼吸道傳染病流行。我國2009年首次報道了HADVB55疫情，導致247名師生及市民發(fā)病，1名學生死亡。考慮到HADV并未列入我國傳染病監(jiān)控病原，現(xiàn)有報道的HADV疫情大多未鑒定型別，因此HADVB55在我國引起的成人急性呼吸道傳染病流行可能遠高于實際報道病例，其潛在威脅不容忽視。由于抗原性上與HADVB11的聯(lián)系和差異，HADVB55早期被命名為HADVB11A。經(jīng)全基因組序列測定和生物信息學分析，HADVB55實際為HADVB11和14的HEXON基因重組突變體。HADVB55作為一個新近受到關(guān)注的呼吸道感染類腺病毒，基因組及生物學特征均未明確。傳統(tǒng)的HADVB11主要導致泌尿系統(tǒng)的感染，HADVB14和55則主要引起呼吸系統(tǒng)感染。因此，明確HADVB55的基因組及生物學特征，闡明重組HADVB55與其親本病毒的聯(lián)系及差異，以及進一步探討呼吸道HADV重組與其致病性上的聯(lián)系，將可加深對呼吸道HADV病原學的認識，并為進一步研究其重組與致病機制奠定基礎(chǔ)。本項研究從HADV感染咽拭子樣本中，利用敏感細胞系分離獲得了HADVB55病毒株，完成了病原學鑒定，對其基因組特征及其進化重組進行了分析，并進一步針對病毒重組，對HADVB55與親本病毒11和14型在生物學特征上的差異進行了系統(tǒng)比較，明確了HADVB55型重組后生物特征學上的改變，并初步探討了HADV重組對病毒生物學特性的影響及其與致病性之間的聯(lián)系。一、新型HADVB55的分離與鑒定我們自2011年山西HADVB55疫情中，從臨床咽拭子樣本中分離獲得了HADVB55毒株Y16SX2011簡稱Y16。該毒株可感染呼吸道細胞系A(chǔ)549及HEP2，并引起明顯的細胞病變，A549細胞在感染24小時后即可觀察到細胞腫脹及圓縮等病變現(xiàn)象，隨著感染時間的延長，在感染48小時后細胞逐步出現(xiàn)了類似拉網(wǎng)樣空泡，而在感染5天后可導致細胞完全圓縮、脫落、融解。分離株可在A549細胞上有效增殖，病毒滴度最高可達245108PFUML，并形成大小均一的噬斑形態(tài)。在電鏡下觀察HADVB55型病毒顆粒，HADVB55型具有與其他HADV相似的電鏡形態(tài)，呈現(xiàn)典型的二十面體形態(tài)。在感染細胞后，細胞顆粒主要集中于細胞核內(nèi)，呈晶格狀排列。小鼠體內(nèi)實驗顯示Y16分離株無法感染小鼠和增殖，僅可引起非特異的病理性損傷。上述分離株病原學特征的初步鑒定，為進一步開展HADVB55型基因組分析、致病機制及疫苗的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。二、HADVB55分離株基因組特征與進化重組分析為了進一步分析Y16分離株的基因組及進化特征，我們對其全長基因進行了序列測定和基因組標注，并進一步以GENBANK公布的HADVB組序列為依據(jù)，進行了進化分析?；谌蚪M序列的進化關(guān)系顯示Y16分離株屬于HADVB2亞組。序列同源性分析表明Y16株與我國2006年山西的QSDLL分離株相似度高，僅有8個核苷酸上的差異與HADVB11的同源性為976％，而與HADVB14的同源性為989％。進一步對Y16主要表面衣殼蛋白HEXON、FIBER、PENTON及E1A蛋白進行了生物信息學分析。結(jié)果顯示分離株的HEXON與HADVB11型同源性較14型高為974％，與HADVB14型的同源性僅為925％但其他幾個蛋白如FIBER、PENTON及E1A蛋白與HADVB14型的同源性均高于99％，顯著高于分離株與HADVB11型的同源性。對分離株的進化關(guān)系分析同樣證實了上述結(jié)果，基于編碼蛋白HEXON、FIBER、PENTON及E1A基因的進化樹分析發(fā)現(xiàn)，Y16的HEXON基因進化關(guān)系與HADVB11相近，而FIBER、PENTON及E1A基因及進化關(guān)系均與HADVB14型屬同一進行分支。進一步對Y16毒株進行重組分析，發(fā)現(xiàn)本次分離到的Y16株為HADVB11型的HEXON蛋白和14型重組后的新型HADV，其重組區(qū)為1869519587位核苷酸區(qū)，其重組特征與之前文獻報道一致。這些結(jié)果明確了我國HADVB55型的基因組及其變異情況，為HADV流行分析與溯源，疫苗研制及制訂疾病防控策略等提供理論依據(jù)。三、HADVB55與重組親本病毒HADV1114的病原學比較研究為了明確HADV重組對HADVB55生物學特征和致病性的影響，我們系統(tǒng)比較了重組Y16分離株與其親本病毒HADVB11和14型細胞組織嗜性和體外生物學特征、不同溫度環(huán)境中在細胞內(nèi)的病毒增殖能力、蝕斑形態(tài)、生長曲線、熱穩(wěn)定性、誘導宿主細胞凋亡、細胞吸附能力和干擾素的動態(tài)變化等方面的差異。研究結(jié)果顯示，HADVB55具有與HADVB11和14類似的一些生物學特征。三個型別的腺病毒均具有廣譜細胞嗜性，在不同組織來源的細胞系內(nèi)均可以實現(xiàn)有效的增殖在A549細胞上均可形成典型的蝕斑形態(tài)。此外，三個型別HADV也可抑制細胞內(nèi)干擾素的產(chǎn)生。電鏡下未發(fā)現(xiàn)形態(tài)存在顯著差異。進一步分析發(fā)現(xiàn)HADVB55與HADVB11和14體外致病性存在一些顯著差異。HADVB55在A549、RD、HEP2、HEPG2、HEK293和HELA等六類細胞系內(nèi)致病變能力、細胞毒性以及致細胞凋亡能力均明顯弱于親本病毒11及14型上述特征將有利于病毒在細胞中的持續(xù)增殖。在模擬上呼吸道環(huán)境中，HADVB55增殖與HADVB14接近，但均快于HADVB11在下呼吸道模擬環(huán)境中，HADVB55的增殖顯著快于HADVB11和14，且在A549細胞上的蝕斑形態(tài)顯著大于親本病毒HADVB11和14型。在熱穩(wěn)定性比較分析中，我們發(fā)現(xiàn)HADVB55型在37℃時的熱穩(wěn)定性明顯弱于親本病毒11和14型的穩(wěn)定性。上述結(jié)果提示基因重組與氨基酸突變在HADVB55型致病機制中的重要作用，HADV衣殼蛋白HEXON的重組，可能與HADV的復(fù)制能力及熱穩(wěn)定性存在著聯(lián)系。本部分的研究結(jié)果為下一步揭示基因重組與HADV毒力變異的關(guān)聯(lián)這一科學問題，為深入探索和闡明不同HADV致病機制與流行特征奠定了基礎(chǔ)。四、HADV55快速檢測方法的建立及評價為滿足HADVB55快速檢測篩查的需要，我們分別建立了環(huán)介導等溫快速檢測方法、實時PCR檢測方法和區(qū)分HADVB111455的多重PCR檢測方法等。這些方法具有較好的敏感性和特異性。其中HADVB55特異LAMP檢測方法，靈敏度與實時定量PCR相當，均可以檢測到0008PFU反應(yīng)同時，該方法還可無須提取核酸過程直接對樣本進行檢測，極大方便了對HADV感染的甄別。我們將上述建立的三種快速檢測方法應(yīng)用到臨床樣本的檢測中。實驗證明三種方法均具有良好的特異性和靈敏度，可適應(yīng)在不同環(huán)境中HADVB55檢測及鑒定，可為臨床及基層醫(yī)療機構(gòu)野外提供快速準確的診斷信息。本研究成功對人腺病毒55型Y16SX2011株進行了分離與鑒定，并完成全基因組序列測定與分析，明確了其與我國QSDLL腺病毒55型分離株的8個核苷酸差異及其進化特征，重組分析顯示分離株為HADVB11和14型的重組產(chǎn)物。進一步的病原學比較研究顯示，HADVB55分離株在細胞嗜性，呼吸道細胞系上的增殖能力均強于親本病毒11和14型，而細胞毒性及致細胞凋亡能力則弱于親本株。本研究對HADVB55基因組特征與生物學特征的闡明，以及與其重組親本的病原學比較，為深入研究腺病毒進化重組機制及其對病毒致病性的影響奠定了基礎(chǔ)，并為腺病毒的防控及疫苗的研究提供了科學依據(jù)。

簡介：點擊查看更多松江區(qū)人群乙型病毒性肝炎血清流行病學研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：手足口病是一類主要由小RNA病毒科腸道病毒屬病毒引起的傳染病主要感染對象是嬰幼兒ENTEROVIRUS71EV71與COXSACKIEVIRUSA16CVA16是引起手足口病的兩個最主要病原體。在2009年1月至2011年5月期間我國發(fā)現(xiàn)的由EV71流行引起的感染病例超過了200萬其中約有1000人死亡。并且EV71的感染者常常會產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)疾病而CVA16導致的手足口病則不會有嚴重的并發(fā)癥。所以針對EV71的研究備受人們關(guān)注。EV71病毒為單股正鏈RNA病毒基因組約有75KB。該基因組編碼一個約250KDA的多聚蛋白這個多聚蛋白被自身產(chǎn)生的2A蛋白酶2APRO和3C蛋白酶3CPRO切割產(chǎn)生11個成熟的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。其中以RNA為模板的RNA聚合酶RNADEPENDENTRNAPOLYMERASERDRP即水解后所產(chǎn)生的3DPOL主要負責病毒的復(fù)制是抗病毒藥物設(shè)計的主要靶點之一。解析出3DPOL的結(jié)構(gòu)再根據(jù)結(jié)構(gòu)特征篩選出特異性的抑制劑對防治手足口病具有重要意義。我們將3DPOL構(gòu)建在了實驗室改造的含有TEV蛋白酶酶切位點的PGEX4T1上來表達蛋白并通過GST親和層析、離子交換和分子篩純化獲得了較純的蛋白。在篩選了大約1800個結(jié)晶條件并對有效條件進行了進一步優(yōu)化后獲得了衍射結(jié)果較好的蛋白晶體。通過在上海同步輻射光源SSRF的衍射實驗我們獲得的3DPOKL分辨率達到了24A。這對基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計篩選抗EV71藥物具有重要意義。

簡介：碩士學位論文上海地區(qū)兒童流感病毒的分子流行病學研究姓學導名科師導師小組成員蔡潔皓兒內(nèi)科學感染病學曾玫教授王曉紅教授楊麗華主任技師王中林副教授20種氨基酸中英文縮寫對照中文名稱英文名稱三字縮寫單字縮寫甘氨酸GLYCINEGLYG丙氨酸ALANINEALAA纈氨酸VALINEVALV亮氨酸LEUCINELEUL異亮氨酸ISOLEUCINEILEI脯氨酸PROLINEPROP苯丙氨酸PHENYLALANINEPHEF酪氨酸TYROSINETYRY色氨酸TRYPTOPHANTRPW絲氨酸SERINESERS蘇氨酸THREONINETHRT半胱氨酸CYSTINECYSC蛋氨酸METHIONINEMETM天冬酰胺ASPARAGINEASNN谷氨酰胺GLUTARNINEGLNQ天冬氨酸ASPARTICACIDASPD谷氨酸GLUTAMICACIDGLUE賴氨酸LYSINELYSK精氨酸ARGININEARGR組氨酸HISTIDINEHISH

簡介：分類號分類號R73371學校代碼學校代碼10392學科專業(yè)代碼學科專業(yè)代碼100201學號號200901218福建醫(yī)科大學碩士研究生畢業(yè)論文慢病毒介導的慢病毒介導的BMI1基因沉默對骨髓瘤細胞生物學基因沉默對骨髓瘤細胞生物學特性及硼替佐米敏感性特性及硼替佐米敏感性影響的研究影響的研究STUDYONSILENCEOFBMI1MEDIATEDBYLENTIVIRUSSHRNAONBIOLOGICALACTERSSENSITIVITYTOBTEZOMIBINMULTIPLEMYELOMACELLS學位類型學位類型醫(yī)學碩士所在學院院協(xié)和臨床醫(yī)學院協(xié)和臨床醫(yī)學院研究生生徐珍珍徐珍珍學科、專業(yè)學科、專業(yè)內(nèi)科學內(nèi)科學血液血液導師師戰(zhàn)榕戰(zhàn)榕教授教授研究起止日期研究起止日期2010年12月至月至2012年3月答辯日期答辯日期2012年6月6日二〇一二年一二年六月目錄英文略縮詞英文略縮詞2中文摘要中文摘要3英文摘要英文摘要5前言前言7第一部分第一部分BMI1SHRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建及穩(wěn)轉(zhuǎn)骨髓瘤細胞株的建立慢病毒表達載體的構(gòu)建及穩(wěn)轉(zhuǎn)骨髓瘤細胞株的建立引言9材料和方法10結(jié)果19討論21結(jié)論24第二部分第二部分BMI1基因沉默對基因沉默對骨髓瘤骨髓瘤細胞生物學特性及增強細胞生物學特性及增強骨髓瘤骨髓瘤細胞細胞對硼替佐米敏感性替佐米敏感性的機制機制研究研究引言25材料和方法26結(jié)果29討論39結(jié)論42全文總結(jié)全文總結(jié)43參考文獻參考文獻44致謝致謝50綜述綜述BMI1基因在多發(fā)性骨髓瘤中的研究進展基因在多發(fā)性骨髓瘤中的研究進展51

簡介：原發(fā)性肝細胞癌（HEPATOCELLULARCARCINOMA，HCC）是世界范圍內(nèi)惡性腫瘤中發(fā)病率居第五、致死率居第三的惡性疾病。每年全世界約有700，000例新增患者，其中男性發(fā)病率遠遠高于女性，且主要集中于東南亞地區(qū)以及非洲撒哈拉沙漠以南區(qū)域，呈現(xiàn)顯著的地域性分布。中國大陸地區(qū)HCC患者數(shù)量占全世界患者數(shù)量的50％，其中男性發(fā)病率為352100，000，女性發(fā)病率為133100，000。病因?qū)W統(tǒng)計顯示54％的HCC患者與乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBV感染關(guān)系密切。雖然HBV疫苗的強制接種使目前中國HBV病毒感染者數(shù)量由975％降到718％，但由于人口基數(shù)龐大以及已有感染者發(fā)生HCC的滯后效應(yīng)等因素的影響，HBV患者的治療和預(yù)防依然是中國社會亟待解決的公共衛(wèi)生安全問題。HBV基因編碼四種蛋白，包括表面抗原HBSAG、核心區(qū)蛋白HBEAG和HBCAG、病毒DNA聚合酶HBP以及HBX。其中HBX是一種多功能的病毒調(diào)節(jié)因子，具有促進肝細胞轉(zhuǎn)化為肝細胞癌的功能。近年來通過酵母雙雜交、染色質(zhì)免疫共沉淀、表達譜芯片分析以及蛋白質(zhì)免疫共沉淀等技術(shù)發(fā)現(xiàn)HBX主要參與調(diào)節(jié)病毒與宿主細胞基因的轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導途徑和蛋白質(zhì)降解水平等多個生物學過程，進一步證實了HBX基因功能的復(fù)雜性和多樣性。盡管在HBX基因功能研究中取得較大成績，但是在研究的策略、實驗?zāi)Ｐ鸵约澳Ｐ偷募膊顟B(tài)方面存在諸多不足。主要體現(xiàn)為研究策略局限于局部的信號或代謝通路，缺乏系統(tǒng)性、整體性的分析，或者僅有基因MRNA水平的系統(tǒng)評價，缺少蛋白質(zhì)水平的系統(tǒng)分析實驗?zāi)Ｐ投嘁曰颊呓M織樣本或體外培養(yǎng)的細胞系為主，忽視了細胞微環(huán)境和遺傳異質(zhì)性等要素對于HBX致病機制研究的干擾。此外，HBX引發(fā)的從肝臟炎癥并發(fā)展至癌癥的進程中的作用機制并沒有得到清晰的闡釋。本研究旨在利用高覆蓋、高精度的定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)探索HBX誘發(fā)小鼠肝臟炎癥向癌癥轉(zhuǎn)化的病理生理學機制。研究依托HBX轉(zhuǎn)基因致肝癌小鼠模型，選擇分別代表HBX誘發(fā)的肝臟炎癥與癌癥病理狀態(tài)的12個月12M和24個月24M的組織作為實驗材料，以HBX轉(zhuǎn)基因小鼠的同窩正常小鼠作為實驗對照，以避免遺傳背景和外界環(huán)境對HBX基因功能研究的干擾。選用實驗室制備的重穩(wěn)定性同位素標記氨基酸完全標記的小鼠作為定量內(nèi)標，實現(xiàn)高精度蛋白質(zhì)組定量。同時，通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)組學技術(shù)，篩選與HBX發(fā)生相互作用的關(guān)鍵分子。以“與HBX相互作用蛋白”為中心點結(jié)合定量蛋白組學數(shù)據(jù)，重構(gòu)“HBX結(jié)合蛋白信號效應(yīng)”的HBX網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖。本研究在國內(nèi)首次發(fā)展了用于小鼠模型的SILAC整體標記方法。利用含有重穩(wěn)定性同位素標記賴氨酸13C6LYSINE的SILAC鼠糧飼養(yǎng)C57BL6小鼠，實現(xiàn)代謝過程中的小鼠蛋白質(zhì)組高標記。對不同器官組織樣品進行標記效率的LCMSMS定量分析，證明F2代小鼠的整體標記效率達到95％以上。其中用于HBX小鼠實驗中的F2代SILAC小鼠肝臟標記效率達到9634％±090％，這為高精度定量蛋白質(zhì)組學研究創(chuàng)造了條件。在蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用研究中，我們共鑒定到162個與HBX相互作用的蛋白。GO分析顯示這些蛋白質(zhì)涉及細胞骨架重構(gòu)、線粒體組份、脂代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞周期調(diào)控和RNA可變剪接等諸多過程。其中47個已經(jīng)被以前的研究證實，占鑒定的162個相互作用蛋白的近30％，顯示了蛋白質(zhì)組學在研究蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用中的可行性。剩余的115個蛋白質(zhì)為首次鑒定的和HBX相互作用的蛋白質(zhì)，體現(xiàn)了我們蛋白質(zhì)組檢測平臺的靈敏度和高覆蓋蛋白質(zhì)組技術(shù)的優(yōu)勢。在這162個HBX相互作用蛋白中，最大的群體是細胞骨架相關(guān)蛋白。共有37個蛋白質(zhì)屬于這個類群，包括肌凝蛋白MYL6B、肌動蛋白相關(guān)蛋白ACTR3B、連環(huán)蛋白ΒCATENIN、驅(qū)動蛋白KIF11和KIF5C、血管抑素結(jié)合蛋白AMOT、肌動蛋白結(jié)合蛋白SVIL等。這些蛋白可通過復(fù)雜的相互作用促進細胞增殖，影響細胞遷移、管狀結(jié)構(gòu)的形成以及偽足的數(shù)量等，并進而影響血管生成。第二大蛋白質(zhì)類群是與線粒體功能活動關(guān)系密切的相互作用蛋白，共32個，包括谷氨酰胺環(huán)化酶ΓGGCT、脫氧尿苷三磷酸酶DUT、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶APRT、CA2的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶家族分子CAMK2D等。這些蛋白質(zhì)參與核酸和氨基酸代謝、RNA可變剪接等生物學過程。特別值得關(guān)注的是HBX不僅可與Β脂肪酸氧化進程中的脂肪酰輔酶A合成酶ACSF2和脂肪羥酰輔酶A脫氫酶家族成員HADH等2個限速酶發(fā)生相互作用，而且還與酯酶分子甾醇載體蛋白SCP2、胰腺三酰甘油脂肪酶PNLIP和脂鈣蛋白酶LCN1發(fā)生相互作用，從而干擾肝細胞脂代謝過程。這可能是HBV介導肝臟脂肪化和炎癥的主要原因。在HBX轉(zhuǎn)基因小鼠的蛋白質(zhì)組研究中，我們共鑒定了4744個蛋白質(zhì)，其中從12MHBX、24MHBX組及其同窩小鼠中分別鑒定了3491、3464和3442、3298FDR＜1％個蛋白質(zhì)，四組樣品中共同鑒定的蛋白質(zhì)有2504個FDR＜1％。在定量研究方面，12MHBX和12MWT組定量分析的蛋白質(zhì)有2816個，定量數(shù)據(jù)的對數(shù)值整體呈現(xiàn)正態(tài)分布，其SD值為02024MHBX和24MWT組定量分析的蛋白數(shù)目為2731個，定量數(shù)據(jù)整體分布的SD值為042。24MHBX組SD值與12MHBX組SD值相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜005），表明在HBX介導的從炎癥向癌癥發(fā)生的進程中，肝臟組織的異質(zhì)性在逐漸增加。以20倍差異作為生物學差異蛋白的篩選標準，我們在12MHBX組樣品中鑒定了22個差異表達蛋白，其中15個呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，7個呈現(xiàn)下調(diào)趨勢在24MHBX組發(fā)現(xiàn)97個差異表達蛋白，其中72個上調(diào)，25個下調(diào)。差異蛋白質(zhì)的GO分析顯示在12MHBX階段肌肉組織發(fā)育等功能顯著異常，這可能與肝臟星狀細胞活化引發(fā)細胞外基質(zhì)纖維化相關(guān)24MHBX結(jié)果顯示氧化還原、肌肉組織發(fā)育、轉(zhuǎn)錄活性、細胞骨架組成、糖代謝、脂代謝、小G蛋白信號途徑等生物學進程顯著富集。尤其是12M和24MHBX介導小鼠肝臟由炎癥向癌癥發(fā)展的過程中，我們分別鑒定了與CDC42信號途徑相關(guān)的3個和15個蛋白質(zhì)表達上調(diào)，這提示CDC42信號途徑激活可能是HBX介導肝臟炎癥向癌癥發(fā)展的主要原因。在12MHBX炎癥組織中雖然沒有發(fā)現(xiàn)線粒體功能紊亂的線索，但觀察到4個與脂代謝關(guān)系密切相關(guān)的蛋白如ADFP、DHTKD1、AKR1C18和CES2表達變化。當HBX介導肝臟由炎癥進入癌癥階段，18個線粒體功能相關(guān)蛋白如NDUFA5、LDHD、IVD和DHTKD1等表達變化顯著。線粒體是細胞脂肪代謝的主要場所之一，研究結(jié)果暗示脂肪代謝紊亂和線粒體功能失調(diào)可能也是HBX引發(fā)肝臟炎癥進展到癌癥的主要原因。將HBX相互作用蛋白質(zhì)組與定量蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)整合，我們發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)在HBX轉(zhuǎn)染累及的細胞骨架和線粒體功能方面具有很好的一致性。我們據(jù)此提出“HBX引發(fā)細胞骨架重塑和線粒體功能失調(diào)擾亂肝細胞脂代謝過程，誘發(fā)肝臟由炎癥向癌癥轉(zhuǎn)化”的假設(shè)，并通過免疫組織化學和蛋白印跡實驗等進行了驗證，進一步說明了我們定量蛋白組學研究結(jié)論的正確性。在此基礎(chǔ)上，我們從HBX誘發(fā)小鼠肝臟炎癥和癌癥階段呈現(xiàn)相似差異的蛋白質(zhì)中篩選獲得了與細胞骨架和脂代謝關(guān)系密切的絲切蛋白COFILIN1，CFL1和脂肪分化相關(guān)蛋白ADIPOSEDIFFERENTIATIONRELATEDPROTEIN，ADFP作為肝病發(fā)生和發(fā)展的候選生物標志物分子進行了深入研究。利用免疫組織化學分析臨床HBVHCC和非HBVHCC肝癌組織樣本中的CFL1和ADFP的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)CFL1和ADFP在HBVHCC肝癌組織中的表達水平明顯高于非HBVHCC，顯示了CFL1和ADFP具有作為生物標志物所必需的保守性和組織特異性。按照肝癌早期預(yù)警與診斷標志物應(yīng)具備特異性高、敏感、重現(xiàn)性好和患者依從性優(yōu)等要素，我們又進一步分析了HBV、HBVHCC和HCV等患者的血清樣本中CFL1和ADFP的蛋白質(zhì)豐度，發(fā)現(xiàn)在HBV以及HBVHCC患者血清中ADFP的豐度顯著升高，而CFL1在血清中未被檢測到。因此，ADFP可作為HBV誘發(fā)肝細胞癌早期預(yù)警及診斷的潛在標志物。綜上所述，本研究依托實驗室的高覆蓋和高精度定量蛋白組學研究技術(shù)平臺，以HBX轉(zhuǎn)基因鼠為基因功能研究模型和SILAC小鼠作為蛋白組學定量內(nèi)標，深入系統(tǒng)地開展了HBX的功能蛋白質(zhì)組學研究，揭示了HBX通過誘發(fā)細胞骨架重塑和干擾線粒體功能引起肝炎向肝癌發(fā)展的分子機制。在此基礎(chǔ)上，通過對大量臨床樣本的研究進一步證實ADFP可能是HBV誘發(fā)的肝細胞癌的早期預(yù)警及診斷標志物，不僅豐富了HBX的生物學功能及其引發(fā)肝病發(fā)生和發(fā)展的分子機制，也為HBV相關(guān)疾病的防診治研究提供了思路和靶標。

簡介：目的病毒性腦炎是由病毒侵犯腦實質(zhì)引起的炎癥性疾病。臨床表現(xiàn)急性起病、發(fā)熱、頭痛、抽搐、精神異常、意識障礙，腦電圖異常及相應(yīng)的腦脊液的變化等。臨床以單純皰疹病毒腦炎HSE為最多見，約占10％20％1。病毒性腦炎屬于中醫(yī)溫病范疇，中醫(yī)對溫病的認識已有數(shù)千年的歷史，在辯證治療上積累了豐富經(jīng)驗，但中醫(yī)辨證多以臨床癥狀為主。利用中西醫(yī)對照的方法對病毒性腦炎患者進行了分期、分型、實驗室診斷指標與中醫(yī)證候間分布規(guī)律的調(diào)查和分析，以期能為臨床辨證提供客觀依據(jù)。方法參考張慶華楊靜芝3提出的標準進行分期；參考鄭建中田時雨4提出的標準進行分型；采用日本光電F7320無紙腦電圖儀進行腦電圖檢查；采用東芝15T核磁共振成像儀器進行影像學檢查。在進行各種檢查之前參考全國高等醫(yī)藥院校試用教材中醫(yī)內(nèi)科學和中醫(yī)診斷學為中醫(yī)辨證標準進行了中醫(yī)辯證分型。所有資料均用SPSS115統(tǒng)計軟件進行分析。結(jié)論1中醫(yī)基本證侯發(fā)生率較高的是火熱證、痰證和風證；發(fā)生率較低的是陰虛證、氣虛證和血瘀證。說明火熱、痰、風是病毒性腦炎的主要病機，但陰虛、氣虛和血瘀在病毒性腦炎的發(fā)病中也起重要作用。中醫(yī)基本證侯有三種組合形式，10種組合形態(tài)。基本證侯組合形式以三證最多，基本證侯的組合形態(tài)以風痰熱證最高。說明病毒性腦炎病機復(fù)雜，臨床需要綜合判斷。21急性期中醫(yī)證侯以熱證、痰證和風證為主，而恢復(fù)期以陰虛證、氣虛證為主；2痰證多見于意識障礙型、精神異常型和混合型，而風證多見于混合型；3風證在腦電圖重度異常中的發(fā)生率明顯高于腦電圖輕度異常組和腦電圖中度異常組；4風證在腦葉組中的發(fā)生率明顯高于丘腦基底節(jié)腦干組。說明病毒性腦炎臨床分期分型、腦電圖改變及病理改變與中醫(yī)證侯之間有一定的相關(guān)性?？勺鳛榕R床辯證的參考指標。

簡介：分類號分類號R7337R7337學校代碼學校代碼103910392學科專業(yè)代碼學科專業(yè)代碼100208100208學號學號21210032292121003229碩士碩士學位學位論文論文論文題目論文題目慢病毒介導慢病毒介導HSAMIR223過表達對過表達對K562細胞生物學特性影響的實驗研究胞生物學特性影響的實驗研究EFFECTSOFLENTIVIRUSMEDIATEDHSAMIR223OVEREXPRESSIONONBIOLOGICALPROPERTIESOFK562學位類別別醫(yī)學醫(yī)學碩士碩士所在學院協(xié)和臨床醫(yī)學院協(xié)和臨床醫(yī)學院申請人姓名莫慧玲姓名莫慧玲學科、?？?、專業(yè)臨床檢驗診斷學業(yè)臨床檢驗診斷學導師曹穎平師曹穎平教授教授答辯委員會主席伍嚴安答辯委員會主席伍嚴安教授教授研究起研究起止時間止時間20142014年1111月至月至20152015年5月答辯日期期20152015年5月2929日二○一五○一五年五月目錄中文摘要中文摘要1ABSTRACT3前言5第一部分第一部分MIRMIR223223慢病毒過表達重組載體質(zhì)粒的構(gòu)建慢病毒過表達重組載體質(zhì)粒的構(gòu)建及在及在K562K562細胞細胞中的表達情況中的表達情況81材料811細胞株812慢病毒載體系統(tǒng)813慢病毒載體構(gòu)建及表達的主要試劑814慢病毒載體構(gòu)建及表達的主要儀器915其他實驗所需的主要試劑和主要儀器916主要試劑的配置102實驗方法1221PCR擴增目的基因片段1222割膠回收1323大腸桿菌感受態(tài)的制備1424目的基因同源重組入表達載體1425重組質(zhì)粒鑒定1626陽性重組質(zhì)粒的大量抽提163慢病毒的包裝1731包裝病毒293T細胞的復(fù)蘇1732293T細胞的傳代1733陽性重組質(zhì)粒的細胞轉(zhuǎn)染1834慢病毒的收獲和濃縮1835慢病毒滴度測定194K562細胞的培養(yǎng)1941培養(yǎng)基成份19

簡介：本論文包括兩部分1犬細小病毒CPV基因組克隆和生物學特性研究；2狂犬病病毒N基因的原核表達及應(yīng)用第一部分犬細小病毒病由犬細小病毒CPV引起，臨床癥狀以出血性腸炎和心肌炎為特征，是目前威脅養(yǎng)犬業(yè)的主要傳染病。犬細小病毒是一種線性單鏈DNA病毒，全長基因組為5323BP，由兩個開放的讀碼框編碼2個結(jié)構(gòu)蛋白和2個非結(jié)構(gòu)蛋白，為自主復(fù)制的細小病毒。本研究首先從發(fā)病犬的糞便中分離獲得了一株北京地區(qū)2004年流行的CPV病毒株，命名為CPVB2004，根據(jù)GENBANK已發(fā)表序列設(shè)計引物，采用分段PCR的方法獲得該病毒的兩個基因片段，并克隆到PMDT18載體，分別命名為PMDCPV2132和PMDCPV2925，連接這兩個DNA片段構(gòu)建包含幾乎全長基因組的克隆，命名為PMDCPV4623，進行序列測定?；蚪M序列分析顯示該分離株B2004與GENBANK發(fā)表序列的核苷酸序列相似性大于993％，與歐洲新西蘭的分離株遺傳關(guān)系最近；分析NS1及VP1的DNA核苷酸序列和蛋白氨基酸序列顯示了相同的特點而且與編碼非結(jié)構(gòu)蛋白讀碼框的核苷酸序列相比，編碼結(jié)構(gòu)蛋白的讀碼框核苷酸序列變異較大。與CPVD和CPVB1979完全基因組序列比對，除了在編碼區(qū)特別是結(jié)構(gòu)蛋白存在一些變異外，3′端非編碼區(qū)在266位缺失了AACC四個堿基；5′端非編碼區(qū)45544616位與全長的基因組CPVD相對應(yīng)缺失了62BP的重復(fù)序列，47654890丟失了125BP的重復(fù)序列，即兩個62BP的重復(fù)序列。根據(jù)VP2的氨基酸序列分析，與已有的標準CPV基因型比較發(fā)現(xiàn)，該毒株426位氨基酸為ASN，555位氨基酸殘基為VAL，為目前流行的CPV2A型分析VP2的核苷酸序列和氨基酸序列同樣得出，CPVB2004與臺灣和歐洲的CPV2A遺傳關(guān)系較近，屬于同一個分枝。為了研究該病毒結(jié)構(gòu)蛋白的細胞定位，構(gòu)建了表達VPLN端區(qū)和VP2基因的真核表達質(zhì)粒PEGFPVP1和PEGFPVP2，轉(zhuǎn)染細胞48H后激光共聚焦顯微鏡LSM510，ZEISS下觀察GFP的表達，了解病毒衣殼蛋白的核運輸功能。轉(zhuǎn)染PEGFPC1載體的細胞，熒光表達量大，且僅存在于細胞質(zhì)；而轉(zhuǎn)染PEGFPVP1的細胞熒光表達主要集中于細胞核，也有部分顯示在細胞核的邊緣轉(zhuǎn)染PEGFPVP2的細胞熒光表達則在細胞質(zhì)和細胞核中分散分布。這些結(jié)果表明重組了VPLN端11個氨基酸殘基MAPPAKRARRG的PEGFPVP1主要在細胞核產(chǎn)生熒光，這11個氨基酸是較強的核定位序列，能夠運送錨釘?shù)鞍踪|(zhì)進入細胞核進而證明了VP1N端單一區(qū)的核定位功能。而攜帶了GFP的VP2沒有足夠強的核運輸功能，把GFP全部運輸?shù)郊毎?。為了進一步了解CPV的生物學特點，觀察了CPV的感染過程，激光共聚焦顯微鏡下觀察病毒接種細胞后448H的CPV病毒粒子的亞細胞定位，病毒在接種細胞8H內(nèi)位于細胞質(zhì)；812H進入細胞核，開始復(fù)制，約16H在細胞核內(nèi)積累大量病毒粒子，24H后出現(xiàn)在細胞質(zhì)，3248H充滿于整個細胞。通過激光共聚焦研究轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和CPV進入的關(guān)系表明，CPV與轉(zhuǎn)鐵蛋白使用相同的受體進入細胞，并且在進入后2H共定位于細胞核周質(zhì)；制備不同組織的原代細胞，接種CPV和TF孵育發(fā)現(xiàn)，TFR是CPV病毒組織特異性的原因，但也有其它因素影響CPV在不同組織細胞的復(fù)制。根據(jù)獲得序列設(shè)計4對SIRNA寡聚核苷酸，構(gòu)建PSISTRIKE系列的U6發(fā)卡結(jié)構(gòu)載體，研究質(zhì)粒介導的SIRNA對CPV病毒復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，分別以CPV的核衣殼蛋白基因和非結(jié)構(gòu)蛋白基因為靶基因，選擇的4段21NT的保守序列，構(gòu)建了小發(fā)夾RNASHTHAIRPINRNA，SHRNA的PSISTRIKE表達載體，并轉(zhuǎn)染FK81細胞篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞，通過病毒感染檢測、細胞活度測定和TCID測定，發(fā)現(xiàn)該種方法介導的SHRNA表達質(zhì)粒能抑制CPV病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制和感染，具有抗病毒作用，但不能完全阻斷病毒的感染。第二部分狂犬病是由狂犬病毒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的人獸共患傳染病，一旦發(fā)病無法救治，100％死亡。狗是最主要的宿主，而且也是感染人與其它動物的主要傳播媒介；目前尚無有效的治療方法，疫苗接種是預(yù)防狂犬病的唯一有效途徑。家養(yǎng)和野生動物接種疫苗并保持較高的抗體水平是預(yù)防和控制狂犬病的最有效途徑，因而對家養(yǎng)和野生動物狂犬病免疫后中和抗體效價的監(jiān)測就顯得尤為重要。以本實驗室已構(gòu)建和保存的質(zhì)粒PGEMTNPCTN為基礎(chǔ)，將N基因亞克隆到表達載體PMALC2X中，構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒PMALNP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109細胞誘導其表達。WESTERN印跡和ELISA驗證了表達純化的MBPNP融合蛋白的抗原性和免疫原性。利用此融合蛋白作為包被抗原，構(gòu)建了一個檢測血清中抗狂犬病抗體水平的間接ELISA檢測體系，通過測定標準陰性血清、陽性血清和采自免疫接種過狂犬病疫苗的犬科動物的抗體水平，表明該EIJSA方法敏感性高，特異性好。測定樣品ELISA的OD值與標準方法RFFIT。測得的中和抗體滴度兩者具有很高的相關(guān)性R09436。安全方便的重組MBPNP融合蛋白能夠用于檢測犬科動物的抗狂犬病抗體水平和免疫原。

簡介：點擊查看更多黃酮類似物的合成、抗病毒活性篩選及十八烷氧乙基替諾福韋酯的合成工藝、抗乙肝病毒藥效學和藥代動力學研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：中南大學博士學位論文EB病毒感染對MICRNA203的表達影響及其相互作用是鼻咽癌發(fā)病學的重要機制姓名俞海波申請學位級別博士專業(yè)病理學與病理生理學指導教師李桂源；盧建紅20120603博士學位論文中文摘要MIR203調(diào)控新靶基因E2F3、CCNGL參與抑制上皮細胞的生長和惡性轉(zhuǎn)化能力】通過MIRBASE軟件分析差異表達MIRNA分子的基本信息，在線MIRNA靶基因預(yù)測軟件TARGETSCAN和MIRANDA對下游靶基因進行分析，并利用熒光素報告載體活性檢測實驗證實E2F3和CCNGL是MIR203的直接調(diào)控的新靶基因。RTPCR和WESTEMBLOT結(jié)果顯示MIR203可以在MRNA和蛋白質(zhì)水平調(diào)控靶基因的表達。MTT和流式細胞結(jié)果表明MIR203具有抑制上皮細胞生長能力，能抑制細胞從GO／G1期向S期轉(zhuǎn)換的進程；MIR203明顯抑制裸鼠移植瘤腫瘤細胞的生長。免疫組化和原為雜交結(jié)果顯示MIR203過表達的裸鼠瘤組織中靶基因E2F3和CCNGL表達下調(diào)。在上皮細胞中過表達靶基因E2F3和CCNGL能夠逆轉(zhuǎn)MIR203對上皮細胞生物學功能的影響?！綥MPL是EB、下調(diào)MIR203的關(guān)鍵病毒蛋白，并且通過激活JNK和NFKB信號通路調(diào)控MIR203的表達】潛伏膜蛋白LMPL和LMP2是EBV編碼的重要癌蛋白。QRTPCR結(jié)果證實EBV通過LMPL參與調(diào)控PRIMIR203和MATUREMIR203表達下調(diào)而LMP2卻無此功能；在EBV和LMPL穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的上皮細胞中沉默LMPL表達后，MIR203的表達量恢復(fù)明顯。免疫組化和原位雜交結(jié)果顯示MIR203在NPC旁較癌組織中表達高；LMPL表達陰性NPC組織較陽性癌組織的MIR203表達明顯增高。LMPL發(fā)揮生物學功能的主要區(qū)域是C端的C“岷L、CTAR2和CTAR3結(jié)構(gòu)域。WESTERNBLOT和QRTPCR結(jié)果顯示LMP1蛋白CTARL和CTAR2結(jié)構(gòu)域通過激活JNK和NFKB信號通路調(diào)控MIR203的表達；而P38信號通路對MIR203的表達沒有明顯影響。同時，II

簡介：計算機病毒防治是計算機信息安全領(lǐng)域的重要課題。隨著全世界網(wǎng)絡(luò)化的程度越來越高，病毒給全世界造成的經(jīng)濟損失還會越來越大。目前反病毒技術(shù)大都是殺毒軟件隨著病毒的出現(xiàn)而不斷的升級，在時間上具有一定的滯后性，這就給我們提出了一個問題防病毒措施是否可以做到變被動為主動，當遇有未知病毒或外來入侵時使其可以具有真正的主動防御能力考慮計算機病毒以及生物病毒的一些特點，我們運用生物學的理論去尋找具有真正意義的主動防御能力的反病毒措施。一方面可以說是從宏觀方面考慮，主要通過整體分析病毒的傳播情況來考慮反病毒措施。由于病毒的傳播特性獨立于每個病毒的具體特征而普遍存在，因此可以通過抽取病毒在傳播方面的公共特征而忽略其具體表現(xiàn)形式，建立正確反應(yīng)病毒傳播特性的數(shù)學模型，本文在第三章在17的基礎(chǔ)上把生物流行病傳播模型應(yīng)用于無尺度網(wǎng)絡(luò)上計算機病毒的傳播，通過模型可以更準確地了解病毒的傳播過程，主要比較了兩種不同的殺毒措施的不同效果。另一方面從微觀考慮，主要是利用人工免疫系統(tǒng)檢測和清除個體病毒。第四章主要利用生物免疫系統(tǒng)的機制來考慮計算機病毒，在此提出對人工免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵模塊識別器進行聚類演化的思想。以上兩個方面都是基于生物理論來解決計算機病毒問題，目標都是尋求能夠快速、自動、演繹的查殺各種未知病毒，遏制病毒的快速繁衍和傳播的方法。