簡介:傳統(tǒng)的診斷,1、問、望、聽、觸經(jīng)驗型判斷的方法。2、化驗/檢驗細胞、組織、大分子、小分子、酶、代謝物;微生物、免疫學、生物化學、病理學等。3、影像學X線、B超、CT、核磁共振、內(nèi)窺鏡等。4、特殊檢查染色體檢查、肌電/腦電/心電、骨密度、原子吸收光譜等。,隨著技術(shù)水平的發(fā)展,這些診斷方法也在不斷的提高和完善,在醫(yī)學實踐中發(fā)揮了巨大的作用。并還將有更先進的方法問世。但這些方法大多存在一個無法克服的缺陷不可預先診斷。,隨著分子生物學和分子遺傳學的發(fā)展,越來越多的證據(jù)表明,絕大多數(shù)疾病的發(fā)生和發(fā)展都與患者的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能改變有關(guān),所以遺傳物質(zhì)的檢查越來越顯得必要?;蛟\斷的定義應用分子生物學方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能變化而作出的或輔助臨床診斷的技術(shù),稱為基因診斷。,,,基因診斷具有靈敏度高、特異性強、費用低,并對許多疾病特別是遺傳性疾病做出預先診斷的優(yōu)點。它是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ脑\斷方法。由于基因診斷發(fā)展的時間不長,人們對于基因,特別是致病基因的了解還有許多空白,因此許多疾病的診斷還主要依靠其他方法。此外,基因診斷的發(fā)展并非取代和拋棄其他方法,而是相互補充,共同發(fā)展。,長期以來,單基因遺傳病的診斷主要靠臨床觀察和一系列生化檢查,但生化學檢查要求有相應基因表達產(chǎn)物的體液或細胞,并對基因產(chǎn)物或代謝異常機理有所了解。但對絕大多數(shù)遺傳病而言,目前還遠未達到這種認識。,診斷方法的變更,理想的診斷方法是對患者基因或DNA本身直接進行分析,因為這種分析擺脫了上述各種限制。機體各種組織的核細胞均有全套基因組DNA,可以作為分析的材料,而不必考慮表達問題,是目前診斷技術(shù)中最具發(fā)展前途的技術(shù)。,基因診斷的對象,1病原生物的侵入,如肝炎、艾滋病、支原體、細菌、寄生蟲。2先天遺傳性疾患,如苯丙酮尿癥、無丙種球蛋白血癥。3后天基因突變引起的疾病,如腫瘤。4其它,如親子鑒定、個體識別、法醫(yī)物證。,基因診斷的內(nèi)容與疾病相關(guān)的遺傳物質(zhì)改變主要有兩類,1遺傳物質(zhì),即DNA或RNA的水平的變化。如病毒感染時病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在人體內(nèi)的從無到有,某些腫瘤中癌基因表達水平的從低到高。,,2遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化,即基因突變。如點突變引起的基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起的基因激活或滅活等等。因此,從理論上說,所有涉及基因結(jié)構(gòu)和功能變化的檢測都屬于基因診斷。,基因診斷的原理核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一?;驹硎腔パa的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈,即能夠進行雜交。這種結(jié)合是特異的,即嚴格按照堿基互補的原則進行,它不僅能在DNA和DNA之間進行,也能在DNA和RNA之間進行。,用一段已知基因的核酸序列作出探針,與變性后的單鏈基因組DNA接觸時,如果兩者的堿基完全配對,它們即互補地結(jié)合成雙鏈,從而表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列。進行基因檢測有兩個必要條件一是必需的特異的DNA探針;二是必需的基因組DNA。當兩者都變性呈單鏈狀態(tài)時,就能進行分子雜交。,,基因探針基因探針(PROBE)就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列,它可以包括整個基因,也可以僅僅是/基因的一部分;可以是DNA本身,也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。,DNA探針根據(jù)其來源有3種1、來自基因組中有關(guān)的基因本身,稱為基因組探針(GENOMICPROBE)2、是從相應的基因轉(zhuǎn)錄獲得了MRNA,再通過逆轉(zhuǎn)錄得到的探針,稱為CDNA探針(CDNAPROBE)。與基因組探針不同的是,CDNA探針不含有內(nèi)含子序列3、可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補的DNA片段,稱為寡核苷酸探針,一、探針的來源,二、探針的制備一般是通過分子克隆(MOLECULARCLONING)獲得的??寺∈侵赣脽o性繁殖方法獲得同一個體、細胞或分子的大量復制品。,當制備基因組DNA探針進,應先制備基因組文庫,即把基因組DNA打斷,或用限制性酶作不完全水解,得到許多大小不等的隨機片段,將這些片段體外重組到運載體(噬菌體、質(zhì)粒等)中去,再將后者轉(zhuǎn)染適當?shù)乃拗骷毎绱竽c肝菌,這時在固體培養(yǎng)基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑,通過原位雜交,從中可篩出含有目的基因片段的克隆,然后通過細胞擴增,制備出大量的探針。,制備CDNA探針,離純化相應MRNA,人工合成寡核苷酸探針,已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量,三、探針的標記,為了確定探針是否與相應的基因組DNA雜交,有必要對探針加以標記,以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號,通常采用放射性同位素32P標記探針的某種核苷酸Α磷酸基。近年來已發(fā)展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體等作為標記物的方法。但都不及同位素敏感。,最常用的探針標記法,缺口平移法NICKTRANSLATION,,隨機引物法即向變性的探針溶液加入6個核苷酸的隨機DNA小片段,作為引物,當后者與單鏈DNA互補結(jié)合后,按堿基互補原則不斷在其3’OH端添加同位素標記的單核苷酸,這樣也可以獲得比放射性很高的DNA探針。,限制性核酸內(nèi)切酶,限制性核酸內(nèi)切酶(RESTRICTIONENDONUCLEASE),又簡稱限制酶或內(nèi)切酶。它們是基因工程和基因診斷重要的一類工具酶。限制酶能特異地識別和切割特異的核苷酸序列,將雙鏈DNA切成較小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上,并被分離出來。,每種限制酶識別和切割的通常為46個核苷酸序列,稱為限制性位點RESTRICTIONSITES或切點。限制酶切割雙鏈DNA的方式有兩種,產(chǎn)生的末端也有兩種第一種是交錯切割,即兩條鏈的切點不在同一水平而是相隔數(shù)個堿基,故斷口產(chǎn)生兩小段自身互補的單鏈,這種末端容易互補連接,稱為粘性末端(COHESIVETERMINUS);,限制性位點,第二種為平整切割,即兩條鏈在同一水平切開,得到平齊末端(BLUNTTERMINUS)。,5′GAATTC3′3′CTTAAG5′,,,5′GGCC3′3′CGCG5′,由于具有相同粘性末端的DNA片段在DNA連接酶的作用下很容易共價連接,因此被廣泛地應用于重組DNA操作中。具有相同平齊末端的DNA片段也可以連接,但連接效率只有粘性末端連接效率的1%。,常用基因診斷的技術(shù),1HYBRIDIZATION2聚合酶鏈反應PCR3限制性片段長度多態(tài)性RFLP4擴增片段長度多態(tài)性AFLP5寡核苷酸探針ASO6單鏈構(gòu)象多態(tài)性SSCP,每個人的DNA是不完全相同的,一般每100-500BP就有一個是不相同的,即多態(tài)性。在兩套基因組DNA中平均有1000萬處不同,它們多位于內(nèi)含子序列中。堿基的變異就可能導致酶切點的消失或新的切點出現(xiàn),當使用同一限制酶切割不同個體基因組DNA時,DNA片段長度出現(xiàn)差異,這種由于內(nèi)切酶切點變化所導致的DNA片段長度的差異,稱為限制性片段長度多態(tài)性(RESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM,RFLP)。RFLP反映了常見的個體間DNA核苷酸的可遺傳性變異,它按照孟德爾方式遺傳。RFLP可用SOUTHERN印跡雜交法檢出。,1RFLPRESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM,,等位基因2由于出現(xiàn)新的切點,DNA片段縮至8KB。,DNA片段電泳后雜交圖,,,,,,,,,RFLP的檢出等位基因1因有額外切點而導致產(chǎn)生兩個長短不同的DNA片段(3KB及5KB)且均能與探針雜交。,在人類基因組中還存在一類DNA重復序列,稱為小衛(wèi)星DNA。它們分布十分廣泛,每個重復單位通常只有幾--幾十個堿基對,但其重復次數(shù)在人群中是高度變異的,又叫數(shù)目變異的串聯(lián)重復(VARIABLENUMBERTANDEMREPEATS,VNTR)。當用限制酶切割VNTR區(qū)時,只要酶切點不在重復區(qū)內(nèi),就可能得到各種長度不同的片段,可用于致病基因的連鎖分析。,串聯(lián)重復的短片段的長度多態(tài)性可以通過PCR擴增后電泳來檢出,并用于致病基因的連鎖分析,這種診斷方法稱為擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)連鎖分析法。PCR擴增后,產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸,故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析。,2AFLP(AMPLIFIEDFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM),當基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時,可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針(ALLELESPECIFICOLIGONUCLEOTIDE,ASO)用同位素或非同位素標記進行診斷。探針通常為長20BP左右的核苷酸。用于探測點突變時需要合成兩種或兩種以上的探針,一種與正常基因序列完全一致,能與之穩(wěn)定地雜交,但不能與突變基因序列雜交;另一種與突變基因序列一致,能與突變基因序列穩(wěn)定雜交,但不能與正?;蛐蛄蟹€(wěn)定雜交,這樣,就可以把只有一個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來。,3ASO(ALLELESPECIFICOLIGONUCLEOTIDE),PCR可結(jié)合ASO,即PCR-ASO技術(shù),即先將含有突變點的基因有關(guān)片段進行體外擴增,然后再與ASO探針作點雜交,這樣大大簡化了方法,節(jié)約了時間,而且只要極少量的基因組DNA就可進行。,等位基因特異的寡核苷酸探針ASO檢測點突變,4、聚合酶鏈反應(POLYMERASECHAINREACTION,PCR),PCR原理,PCR原理,,,1變性,PCR原理,,,1復性,,,PCR原理,,,1延伸,,,,,PCR原理,,,2變性,,,,,PCR原理,,,2復性,,,,,,,,,PCR原理,,,2延伸,,,,,,,,,,,,,PCR原理,,,3變性,,,,,,,,,,,,,PCR原理,,,3復性,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,PCR原理,,,3延伸,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,DNA以指數(shù)形式擴增2N,其中長片段以線性形式擴增2N2,最終主產(chǎn)物片段長度在兩個引物之間。,預變性9295?C,25M,變性9295?C,30S,復性4060?C,30S,延伸72?C,3060S,總延伸72?C,7M,,,,,,2535,PCR的一般過程,經(jīng)過30次的循環(huán),擴增的DNA片段可達100萬倍以上。,5、SOUTHERN雜交法,細胞,基因診斷的臨床檢測應用,1基因診斷在感染性疾病檢測中的應用乙型肝炎病毒(HBV)、人乳頭瘤病毒(HPV)其DNA可以使用點雜交、PCR方法直接檢出。丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)其RNA可以使用RTPCR方法直接檢出。結(jié)核桿菌和瘧原蟲的分型可以使用探針雜交和PCR方法檢出。,丙型肝炎HCV基因診斷實例,丙型肝炎為RNA病毒,9500MER,編碼30113033個氨基酸,具有高變異性?;蚪M組成,NCR非編碼區(qū),5′NCR為保守的區(qū)域,將引物設(shè)計在該區(qū)域,進行RTPCR,可特異性的擴增HCV。,PCR引物5’GATTCTCGAGGCGACACTCCACCATAGAT5’ATACTCGAGGTGCACGGTCTACGAGACCT,2基因診斷在遺傳病檢測中的應用鐮狀細胞貧血癥(?GLOBIN,?6),其GAG?GTG的突變,可用RFLP(MSTII,CCTNAGG)或PCRSSCP檢出。,甲型血友?。‵VIII-,XR)可用PCRRFLP檢出。,,,142BP99BP,3基因診斷在腫瘤檢測中的應用在許多腫瘤中存在的癌基因RAS、MYC等的突變抗癌基因P53、RB等的突變、丟失可用PCR、PCRASO、PCRSSCP等方法檢出。,4基因診斷在個體識別中的應用鑒定基因多態(tài)性的方法均可用于親子鑒定、個體識別、法醫(yī)物證,基因治療(GENETHERAPY),基因治療的策略,1、生殖細胞基因治療生殖細胞基因治療GERMCELLGENETHERAPY是將正?;蜣D(zhuǎn)移到患者的生殖細胞(精細胞、卵細胞中早期胚胎)使其發(fā)育成正常個體,顯然,這是理想的方法。1、體細胞基因治療體細胞基因治療SOMATICCELLGENETHERAPY是指將正常基因轉(zhuǎn)移到體細胞,使之表達基因產(chǎn)物,以達到治療目的。,基因治療的方法,1.基因轉(zhuǎn)移方法(1)特異正?;虻姆蛛x與克隆(2)外源基因的轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移(GENETRANSFER)是將外源基因?qū)爰毎麅?nèi)。,基因轉(zhuǎn)移方法,1)化學法將正?;駾NA(及其拷貝)與帶電荷物質(zhì)和磷酸鈣、DEAE-葡萄糖或與若干脂類混合,形成沉淀的DNA微細顆粒,直接傾入培養(yǎng)基中與細胞接觸,由于鈣離子有促進DNA透過細胞有作用,某些化合物可擾亂細胞膜,故可將DNA輸入細胞內(nèi),并整合于受體細胞的基因組中,在適當?shù)臈l件下,整合基因得以表達,細胞亦可傳代。方法簡單,但效率極低,一般1000-100000個細胞中只有一個細胞可結(jié)合導入的外源基因。,2)物理法包括電穿孔法和直接顯微注射法,①電穿孔法電穿孔法(ELECTROPOROTION)是將細胞置于高壓脈沖電場中,通過電擊使細胞產(chǎn)生可逆性的穿孔,周圍基質(zhì)中的DNA可滲進細胞,但有時也會使細胞受到嚴重損傷。②顯微注射法顯微注射(MICROINJECTION)是在顯微鏡直視下,向細胞核內(nèi)直接注射外源基因,這種方法應是有效的。但一次只能注射一個細胞,工作耗力費時。此法用于生殖細胞時,有效率可達10%。直接用于體細胞卻很困難。,③脂質(zhì)體法脂質(zhì)體(LIPOSOME)法是應用人工脂質(zhì)體包裝外源基因,再與靶細胞融合,或直接注入病灶組織,使之表達。,3)同源重組法同源重組(HOMOLOGOUSRECOMBINATION)是將外源基因定位導入受體細胞的染色體上,在該座位因有同源序列,通過單一或雙交換,新基因片段替換有缺陷的片段,達到修正缺陷基因的目的。,4)病毒介導基因轉(zhuǎn)移前述的化學和物理方法都是通過傳染方式基因轉(zhuǎn)移。病毒介導基因轉(zhuǎn)移(VIRALMEDIATEDGENETRANSFER)是通過轉(zhuǎn)換方式完成基因轉(zhuǎn)移,即以病毒為載體(VECTOR),將外源目的基因通過基因重組技術(shù),將其組裝于病毒上,讓這種重組病毒去感染受體宿主細胞,這種病毒稱為病毒運載體(VIRALVECTOR)。,兩種病毒介導基因轉(zhuǎn)移方法,①反轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒雖是RNA病毒,但有反轉(zhuǎn)錄酶,可使RNA轉(zhuǎn)錄為DNA,再整合到宿主細胞基因組。②DNA病毒介導載體(DNAVIRALMEKIATEDVECTOR)DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、皰疹病毒等。,1、靶細胞,靶細胞是指接受轉(zhuǎn)移基因的體細胞。選擇靶細胞的原則是①必須較堅固,足以耐受處理,并易于由人體分離又便于輸回體內(nèi);②具有增殖優(yōu)勢,生命周期長,能存活幾月至幾年,最后可延續(xù)至病人的整個生命期③易于受外源遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化;④在選用反轉(zhuǎn)錄病毒載體時,目的基因表達最好具有組織特異性的細胞。,基因治療存在問題與倫理學,存在著若干重要問題1.導入基因的穩(wěn)定高效表達外源基因轉(zhuǎn)移入病人體內(nèi)細胞表達,首先與轉(zhuǎn)移方法有關(guān)。化學和物理方法所導入的基因效率低,自然表達也差。2.導入基因的安全性基因治療的安全性應確保不因?qū)胪庠茨康幕蚨a(chǎn)生新的有害遺傳變異,這是因為采用反轉(zhuǎn)錄病毒載體而引起的問題。,3.基因治療與社會倫理道德體細胞基因治療是符合倫理道德的,但試圖糾正生殖細胞遺傳缺陷或通過遺傳工程手段來改變正常人的遺傳特征則是引起爭議的領(lǐng)域。,基因治療必須具備下列條件,①選擇適當?shù)募膊?,并對其發(fā)病機理及相應基因的結(jié)構(gòu)功能了解清楚;②糾正該病的基因已被克隆,并了解該基因表達與調(diào)控的機制與條件;③該基因具有適宜的受體細胞并能在體外有效表達;④具有安全有效的轉(zhuǎn)移載體和方法,以及可供利用的動物模型。,
下載積分: 4 賞幣
上傳時間:2024-01-06
頁數(shù): 63
大?。?0.45(MB)
子文件數(shù):